LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl) - ElrinAlria
LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)
LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA II
PERCOBAAN I
ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)

A. Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukan percobaan ini adalah :
  1. Memahami dan melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon. 
  2. Memahami dan dapat melaksanakan analisis kualitatif golongan senyawa tersebut dengan metode kromatografi lapis tipis. 

B. Teori Umum
Selama ini, masyarakat hanya mengenal daun singkong sebagai sayuran dan bahan makanan. Masyarakat kurang mengetahui bahwa daun singkong memiliki banyak manfaat di dunia kesehatan karena memiliki kandungan vitamin C yang cukup tinggi (sekitar 27,5%), senyawa organik flavonoid, triterpenoid, tanin serta saponin. Flavonoid dan saponin sejak lama diketahui memiliki aktivitas antimikroba dan antivirus. Demikian juga triterpenoid yang sering ditemukan pada banyak tanaman obat dan diketahui memiliki aktivitas antivirus dan antibakteri, serta dapat mengobati kerusakan pada kulit.11 Flavonoid yang diisolasi dari daun singkong sebesar 100-200 μg/ml dapat mengurangi degranulasi sel mast yang diinduksi senyawa 48,80 albumin pada sebuah penelitian in vitro. Flavonoid diyakini dapat menghambat prostaglandin [1]. 

Senyawa bioakif umumnya dihasilkan melalui metabolisme sekunder. Berbeda dengan metabolit primer, metabolit sekunder lebih berperan dalam pertahanan dan peran ekologis tanaman dengan lingkungannya. Tiga kelompok besar senyawa metabolit sekunder pada tumbuhan antara lain terpenoid, alkaloid, dan senyawa fenol. Flavonoid merupakan derivat dari senyawa fenol. Secara umum, flavonoid merupakan senyawa dengan 15 atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Gugus hidroksil (-OH) hampir selalu terdapat dalam flavonoid, khususnya pada cincin B di posisi 3’ dan 4’, cincin A pada posisi 5 dan 7, atau cincin C pada posisi 3. Gugus hidroksil ini merupakan tempat menempelnya berbagai gula yang dapat meningkatkan kelarutan flavonoid dalam air. Sebagian besar flavonoid disimpan dalam vakuola tengah, walaupun disintesis di luar vakuola[2]. 

Berdasarkan strukturnya, menggolongkan flavonoid dalam enam kelompok antara lain aglikon (flavonoid tanpa gula terikat), flavonoid-C-glikosida (flavonoid yang terikat gula pada inti benzena), flavonoid-O-glikosida (flavonoid yang terikat gula pada gugus hidroksilnya), biflavonoid (flavonoid biner), flavonoid sulfat (flavonoid yang berikatan dengan satu atau lebih gugus sulfat), dan aglikon yang bersifat optis aktif. Sedangkan menurut fungsi fisiologisnya flavonoid dikelompokkan menjadi tiga, yaitu antosianin (flavonoid yang berperan sebagai pigmen warna), flavonol dan flavon (perlindungan terhadap radiasi UV berlebih dan sebagai sinyal biologis), dan isoflavon (flavonoid biner yang banyak berperan sebagai senyawa pertahanan). Walaupun terlihat beragam, namun golongan flavonoid disintesis oleh prekursor yang sama (fenilalanin, yang merupakan asam amino aromatik) melalui jalur biosintesis asam sikimat yang khas hanya terdapat pada tumbuhan[2].

Flavonoid terdapat pada seluruh bagian tanaman, termasuk pada buah, tepung sari, dan akar. Flavonoid di dala tumbuhan biasanya terikat dengan gugus gula sebagai glikosida dan aglikon dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Flavonoid juga mengandung sistem aromatik terkonjugasi sehingga akan menunjukkan serapan kuat pada daerah spektrum sinar UV dan spektrum sinar tampak. Aglikon flavonoid merupakan polifenol yang mempunyai sifat kimia yang sama seperti senyawa fenol yaitu memiliki sifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Flavonoid yang telah diisolasi dari tumbuhan mempunyai berbagai keaktifan biologis antara lain mempunyai keaktifan sebagai obat, insektisida, antimikroba, anti virus, anti jamur, obat infeksi pada luka, mengurangi pembekuan darah di dalam tubuh, mempercepat pembekuan darah di luar tubuh, merangsang pembentukan estrogen pada mamalia, antihipertensi, antioksidan, anti tumor dan kanker[3].

Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan karena flavonoid bertindak sebagai free radical scavengers dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Atom hidrogen yang dilepaskan mampu berikatan dengan radikal bebas, hingga bermuatan netral. Flavonoid yang kehilangan atom hidrogen kemudian mengalami resonansi dari gugus hidroksil yang menyebabkan energi aktivitasnya berkurang dan tetap stabil. Radikal bebas yang sudah distabilkan akan berhenti melakukan reaksi berantai sehingga mencegah terjadinya kerusakan lipid, protein, atau DNA[2].

Pemisahan merupakan aspek yang paling penting dalam bidang kimia karena kebanyakan materi yang terdapat di alam berupa campuran, sehingga untuk mendapatkan materi yang murni (isolat) dari suatu campuran, maka dilakukan proses pemiahan[3]. Kemurnian senyawa hasil isolasi diuji dengan pola noda KLT dan titik leleh. Identifikasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan spektrofotometri IR[5].

Perlakuan hidrolisis terhadap ekstrak ini karena flavonoid di dalam tanaman pada umum terdapat dalam bentuk glikosida. Senyawa glikosida flavonoid ini pada saat dikonsumsi akan terhidrolisis di lambung menjadi bentuk aglikonnya. Hidrolisis dilakukan dengan menggunakan asam klorida pada pH 2-3 dengan tujuan memecah glikosida flavonoid menjadi aglikon flavonoid dan gulanya[4].

Langkah berikutnya setelah diperoleh ekstrak dalam isolasi senyawa organik bahan alam adalah pemisahan komponen-komponen yang terdapa dalam ekstrak tersebut. Teknik yang banyak digunakan adalah kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Beberapa teknik kromatografi yang banyak digunakan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom vakum (KCV), kromatgorafi kolom gravitasi (KG), dan kromatotron[6].

Kromatografi lapis tipis adalah suatu teknik pemisahan komponen-komponen campuran suatu senyawa yang melibatkan partisipasi suatu senyawa di antara padatan penyerap (adsorbent, fasa diam) yang dilapiskan pada pelat kaca atau aluminium dengan suatu pelarut (fasa gerak) yang mengalir melewati adsrobent (padatan penyerap). Pengaliran pelarut dikenal sebagai proses pengembangan oleh pelarut (elusi). KLT mempunyai peranan penting dalam pemisahan senyawa organik maupun senyawa anorganik, karena relatif sederhana dan kecepatan analisisnya. Di dalam analisis dengan KLT, sampel dalam jumlah yang sangat kecil ditotolkan menggunakan pipa kapiler di atas permukaan pelat tipis fase diam (adsorbent), kemuadian pelat diletakkan dengan tegak dalam bejana pengembang yang berisi sedikit pelarut pengembang. Oleh aksi kapiler, pelarut mengembang naik sepanjang permukaan lapisan pelat dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam sampel[6].

Pemilihan fasa gerak yang tepat merupakan langkah yang sangat penting untuk keberhasilan analisis dengan KLT. Umumnya, fasa gerak dalam KLT ditemukan dengan coba-coba dan jarang sekali yang didasarkan pada pengetahuan yang mendalam. Sifat-sifat pelarut pengembang juga merupakan faktor dominan dalam penentuan mobilitas komponen-komponen campuran. Umumnya, kemampuan suatu pelarut pengembang untuk menggerakkan senyawa pada suatu adsorben berhubungan dengan polaritas pelarut[6].

C. Uraian Tanaman
1. Klasifikasi Ketela Pohon[7] 
Regnum : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Bangsa : Euphorbiales
Famili : Euphorbiaceae
Genus : Manihot
Spesies : Manihot utilissima Pohl.

2. Deskripsi
Batang tanaman ubi kayu berkayu, beruas-ruas, dan panjang, yang ketinggiannya dapat mencapai 3 meter lebih. Warna batang bervariasi, tergantung kulit luar, tetapi batang yang masih muda umunya berwarna hijau dan setelah tua menjadi keputih-putihan, kelabu, hijau kelabu, atau coklat kelabu. Empulur batang berwarna putih, lunak, dan strukturnya empuk seperti gabus. Daun ubi kayu mempunyai susunan berurat menjari dengan canggap 5-9 helai. Daun ubi kayu biasanya mengandung racun asam sianida atau asam biru, terutama daun yang masih muda (pucuk). Tanaman ubi kayu dapat beradaptasi luas di daerah beriklim panas (tropis)[7].

D. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • a. Batang pengaduk
  • b. Hot plate
  • c. Erlenmeyer 500 ml
  • d. Erlenmeyer 1000 ml
  • e. Corong
  • f. Rabung reaksi
  • g. Spatula
  • h. Plat KLT
  • i. Pipet kapiler
  • j. Gelas kimia
  • k. Waterbath
  • l. Corong pisah 250 ml
  • m. Cawan porselen
  • n. Lampu UV-Vis
  • o. Oven

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu: 
  • a. Akuades 
  • b. Serbuk daun singkong kering 100 gram
  • c. Etanol 96%
  • d. HCl 2 N
  • e. n-heksan
  • f. Aluminium foil
  • g. Dietil eter
  • h. Metanol 
  • i. Na2SO4¬
  • j. Kapas
  • k. Kertas saring

E. Prosedur Kerja
LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)



F. Hasil Pengamatan
LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)

G. Pembahasan
Isolasi senyawa kimia dari bahan alam adalah sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni. Tanaman mengandung ribuan senyawa yang dikategorikan sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami ini mentargetkan untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia. Sehingga praktikum kali ini dilakukan untuk mengisolasi rutin (flavonoid-3-glikosida) sebagai salah satu jenis glikosida flavonoid (glikosida flavonol) yang terkandung dalam daun singkong/ketela pohon.

Tanaman singkong berasal dari Brazilia tetapi sekarang sudah tersebar hampir di seluruh dunia. Indonesia termasuk salah satu negara penghasil singkong utama dunia setelah Brazilia dan Zaire. Tanaman Singkong banyak di tanam di daerah-daerah berlahan kering dengan sistem pengairan yang hanya mengandalkan air hujan. Tanaman singkong dapat diolah sebagai bahan makanan, dan daunnya dibuat sayuran, tetapi untuk pengobatan masih jarang digunakan. Salah satu senyawa yang terkandung di dalam daun singkong adalah flavonoid rutin. Rutin merupakan senyawa turunan dari flavonoid. 

Glikosida adalah senyawa yang menghasilkan satu atau lebih gula dan komponen bukan gula pada reaksi hidrolisis. Glikosida terdiri atas gabungan dua bagian senyawa, yaitu gula (glikon) dan bukan gula (aglikon atau genin).Kedua bagian senyawa tersebut dihubungkan oleh suatu ikatan berupa jembatan oksigen (O-glikosida, dioksin), jembatan nitrogen (N-glikosida, adenosin), jembatan sulfur

(S-glikosida, sinigrin), maupun jembatan karbon (C-glikosida, barbaloin). Berdasarkan strukturnya, flavonoid merupakan senyawa induk flavon yang terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan Primula, dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama. Saat ini dikenal sekitar 20 jenis flavonoid, yang berupa senyawa yang larut dalam air. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambahkan basa atau amoniak, sehingga flavonoid mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan.

Glikosida flavonoid termasuk rutin merupakan salah satu metabolit sekunder yang bersifat polar, termasuk kedalam kelompok glikosida O (molekul gula berikatan dengan O-aglikon). Rutin daun singkong (satu zat aktif) sebagai bahan obat-obatan dan kosmetik, serta jadi zat pengatur tumbuh tanaman. Karena sifatnya yang polar maka pengisolasian rutin dilakukan dengan penggunaan pelarut polar yaitu air, dengan penggunaan air yang kemudian dipanaskan membuat semua senyawa polar tertarik bersama filtrate. Hal ini merupakan salah satu kerugian penggunaan air sebagai pelarut karena, banyak sekali komponen-komponen polar yang dapat larut bersama air. Sehingga metode yang digunakan yaitu metode infundasi. 

Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan zat aktif yang larut dalam air dan bahan-bahan nabati. Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh karena itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Digunakan metode infundasi karena proses cepat serta pelarut yang digunakan adalah air yang bersifat polar. Setelah dilarutkan menggunakan air yang dipanaskan, selanjutnya dilakukan proses pemisahan antara filtrat dan residu tanaman singkong.

Filtrat yang diperoleh kemudian disimpan dalam lemari pendingin untuk mempercepat pembentukan kristal rutin dan mencegah terjadinya penjamuran. Karena media air yang digunakan memungkinkan timbulnya jamur atau bakteri jika disimpan di suhu ruang. Endapan yang diperoleh disaring dan dicuci dengan menggunakan etanol dingin dengan tujuan agar kemurnian filtrat menjadi bertambah dan terbebas dari pengotor-pengotor yang tidak ingin diisolasi, namun tidak menyebabkan kristal yang dicuci menjadi larut. 

Kristal yang diperoleh disaring dan dikeringkan menggunakan oven selama 3 jam. Setelah kering, dilakukan uji titik leleh untuk membandingkan titik leleh rutin yang telah ada pada literatur dengan rutin yang diperoleh pada saat praktikum. Ketika memiliki titik leleh yang sama, hal ini menyatakan bahwa percobaan untuk mendapatkan isolasi glikosida flavonoid ini berhasil. Titik leleh pada instrumen di atur pada 330oC – 360 oC. Pada saat dilakukan pengukuran di uji titik lelehnya menggunakan alat automatic melting point, hasil dari pengukuran titik leleh dari kristal sampel yang diperolah tidak sesuai dengan literatur yaitu sekitar 242oC. Hasil yang kami peroleh yaitu 342,9 oC serta tidak menunjukkan pergerakan dari rutin menggambarkan kristalnya yang telah meleleh. Hal ini dapat dilihat dari perubahan warna bahan menjadi hitam saat diukur titik lelehnya dan pada isolat juga menunjukkan secara organoleptik berwarna hijau. Seharusnya isolat rutin berwarna kuning. 

Hal ini bisa terjadi karena kesalahan pada saat preparasi sampel yang seharusnya dicuci oleh metanol dingin yang dicampur dengan air dingin. Karena rutin dapat terbentuk pada suhu rendah dan salah satunya adalah kurangnya ketelitian dari praktikan.

H. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
  1. Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar, sehingga dapat diekstraksi dengan pelatur polar, seperti air, metanol atau etanol. Filtrat yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk mempercepat pembentukan kristal. Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. 
  2. Analisa dari aglikon dan glikosida ini dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dan menggunakan eluen tertentu sesuai dengan kepolaran senyawa yang dianalisa. 

DAFTAR PUSTAKA
[1] Meilawaty, Z., 2013, Efek Ekstrak Daun Singkong (Manihot utilissima) terhadap Ekspresi COX-2 pada Monosit yang Dipapar LPS E. Coli, Dental Journal Majalah Kedokteran Gigi, Vol. 40 (4). 

[2] Pambudi, A., Syaefudin, Nita N., Risa S., Purwanty R.A., 2014, Identifikasi Bioaktif Golongan Flavonoid Tanaman Anting-Anting (Acalypha indica L.), Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, Vol. 2 (3).

[3] Putra, R.T., Yani L., Reza A.K., 2015, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dalam Tumbuhan Lamun Cymodocea rotundata Ehrenberg & Hemprich Ex Ascherson, Prosiding Penelitian SPeSIA Unisba (Kesehatan dan Farmasi), Farmasi Gelombang 2.

[4] Daniatik, Suwijoyo P.,Sugeng R., 2015, Penentuan Kadar Flavonoid Total Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Kloroform Hasil Hidrolisis Ekstrak Etanolik Daun Kepel (Stelechocarpus burahol (BL) Hook f. & Th.) dengan Metode Spektrofotometr Menggunakan Rutin sebagai Pembanding, Kartika Jurnal Ilmiah Farmasi, Vol. 3 (1). 

[5] Pasaribu, S.P., Erwin, Putri I., 2014, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dari Daun Tumbuhan Kerehau (Callicarpa longifolia Lam.), Jurnal Kimia Kemahasiswaan, Vol. 11 (2).

[6] Atun, S., 2014, Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan Alam, Jurnal Konservasi Cagar Budaya Borobudur, Vol. 8 (2).

[7] Thamrin, M., Ainul M., Samsul Em., 2013, Analisis Usahatani Ubi Kayu (Manihot utilissima), Agrium, Vol. 18 (1).

LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)

LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)
LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA II
PERCOBAAN I
ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)

A. Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukan percobaan ini adalah :
  1. Memahami dan melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon. 
  2. Memahami dan dapat melaksanakan analisis kualitatif golongan senyawa tersebut dengan metode kromatografi lapis tipis. 

B. Teori Umum
Selama ini, masyarakat hanya mengenal daun singkong sebagai sayuran dan bahan makanan. Masyarakat kurang mengetahui bahwa daun singkong memiliki banyak manfaat di dunia kesehatan karena memiliki kandungan vitamin C yang cukup tinggi (sekitar 27,5%), senyawa organik flavonoid, triterpenoid, tanin serta saponin. Flavonoid dan saponin sejak lama diketahui memiliki aktivitas antimikroba dan antivirus. Demikian juga triterpenoid yang sering ditemukan pada banyak tanaman obat dan diketahui memiliki aktivitas antivirus dan antibakteri, serta dapat mengobati kerusakan pada kulit.11 Flavonoid yang diisolasi dari daun singkong sebesar 100-200 μg/ml dapat mengurangi degranulasi sel mast yang diinduksi senyawa 48,80 albumin pada sebuah penelitian in vitro. Flavonoid diyakini dapat menghambat prostaglandin [1]. 

Senyawa bioakif umumnya dihasilkan melalui metabolisme sekunder. Berbeda dengan metabolit primer, metabolit sekunder lebih berperan dalam pertahanan dan peran ekologis tanaman dengan lingkungannya. Tiga kelompok besar senyawa metabolit sekunder pada tumbuhan antara lain terpenoid, alkaloid, dan senyawa fenol. Flavonoid merupakan derivat dari senyawa fenol. Secara umum, flavonoid merupakan senyawa dengan 15 atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik yang dihubungkan oleh tiga karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Gugus hidroksil (-OH) hampir selalu terdapat dalam flavonoid, khususnya pada cincin B di posisi 3’ dan 4’, cincin A pada posisi 5 dan 7, atau cincin C pada posisi 3. Gugus hidroksil ini merupakan tempat menempelnya berbagai gula yang dapat meningkatkan kelarutan flavonoid dalam air. Sebagian besar flavonoid disimpan dalam vakuola tengah, walaupun disintesis di luar vakuola[2]. 

Berdasarkan strukturnya, menggolongkan flavonoid dalam enam kelompok antara lain aglikon (flavonoid tanpa gula terikat), flavonoid-C-glikosida (flavonoid yang terikat gula pada inti benzena), flavonoid-O-glikosida (flavonoid yang terikat gula pada gugus hidroksilnya), biflavonoid (flavonoid biner), flavonoid sulfat (flavonoid yang berikatan dengan satu atau lebih gugus sulfat), dan aglikon yang bersifat optis aktif. Sedangkan menurut fungsi fisiologisnya flavonoid dikelompokkan menjadi tiga, yaitu antosianin (flavonoid yang berperan sebagai pigmen warna), flavonol dan flavon (perlindungan terhadap radiasi UV berlebih dan sebagai sinyal biologis), dan isoflavon (flavonoid biner yang banyak berperan sebagai senyawa pertahanan). Walaupun terlihat beragam, namun golongan flavonoid disintesis oleh prekursor yang sama (fenilalanin, yang merupakan asam amino aromatik) melalui jalur biosintesis asam sikimat yang khas hanya terdapat pada tumbuhan[2].

Flavonoid terdapat pada seluruh bagian tanaman, termasuk pada buah, tepung sari, dan akar. Flavonoid di dala tumbuhan biasanya terikat dengan gugus gula sebagai glikosida dan aglikon dalam beberapa bentuk kombinasi glikosida. Flavonoid juga mengandung sistem aromatik terkonjugasi sehingga akan menunjukkan serapan kuat pada daerah spektrum sinar UV dan spektrum sinar tampak. Aglikon flavonoid merupakan polifenol yang mempunyai sifat kimia yang sama seperti senyawa fenol yaitu memiliki sifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Flavonoid yang telah diisolasi dari tumbuhan mempunyai berbagai keaktifan biologis antara lain mempunyai keaktifan sebagai obat, insektisida, antimikroba, anti virus, anti jamur, obat infeksi pada luka, mengurangi pembekuan darah di dalam tubuh, mempercepat pembekuan darah di luar tubuh, merangsang pembentukan estrogen pada mamalia, antihipertensi, antioksidan, anti tumor dan kanker[3].

Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan karena flavonoid bertindak sebagai free radical scavengers dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Atom hidrogen yang dilepaskan mampu berikatan dengan radikal bebas, hingga bermuatan netral. Flavonoid yang kehilangan atom hidrogen kemudian mengalami resonansi dari gugus hidroksil yang menyebabkan energi aktivitasnya berkurang dan tetap stabil. Radikal bebas yang sudah distabilkan akan berhenti melakukan reaksi berantai sehingga mencegah terjadinya kerusakan lipid, protein, atau DNA[2].

Pemisahan merupakan aspek yang paling penting dalam bidang kimia karena kebanyakan materi yang terdapat di alam berupa campuran, sehingga untuk mendapatkan materi yang murni (isolat) dari suatu campuran, maka dilakukan proses pemiahan[3]. Kemurnian senyawa hasil isolasi diuji dengan pola noda KLT dan titik leleh. Identifikasi senyawa hasil isolasi dilakukan dengan spektrofotometri IR[5].

Perlakuan hidrolisis terhadap ekstrak ini karena flavonoid di dalam tanaman pada umum terdapat dalam bentuk glikosida. Senyawa glikosida flavonoid ini pada saat dikonsumsi akan terhidrolisis di lambung menjadi bentuk aglikonnya. Hidrolisis dilakukan dengan menggunakan asam klorida pada pH 2-3 dengan tujuan memecah glikosida flavonoid menjadi aglikon flavonoid dan gulanya[4].

Langkah berikutnya setelah diperoleh ekstrak dalam isolasi senyawa organik bahan alam adalah pemisahan komponen-komponen yang terdapa dalam ekstrak tersebut. Teknik yang banyak digunakan adalah kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Beberapa teknik kromatografi yang banyak digunakan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom vakum (KCV), kromatgorafi kolom gravitasi (KG), dan kromatotron[6].

Kromatografi lapis tipis adalah suatu teknik pemisahan komponen-komponen campuran suatu senyawa yang melibatkan partisipasi suatu senyawa di antara padatan penyerap (adsorbent, fasa diam) yang dilapiskan pada pelat kaca atau aluminium dengan suatu pelarut (fasa gerak) yang mengalir melewati adsrobent (padatan penyerap). Pengaliran pelarut dikenal sebagai proses pengembangan oleh pelarut (elusi). KLT mempunyai peranan penting dalam pemisahan senyawa organik maupun senyawa anorganik, karena relatif sederhana dan kecepatan analisisnya. Di dalam analisis dengan KLT, sampel dalam jumlah yang sangat kecil ditotolkan menggunakan pipa kapiler di atas permukaan pelat tipis fase diam (adsorbent), kemuadian pelat diletakkan dengan tegak dalam bejana pengembang yang berisi sedikit pelarut pengembang. Oleh aksi kapiler, pelarut mengembang naik sepanjang permukaan lapisan pelat dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam sampel[6].

Pemilihan fasa gerak yang tepat merupakan langkah yang sangat penting untuk keberhasilan analisis dengan KLT. Umumnya, fasa gerak dalam KLT ditemukan dengan coba-coba dan jarang sekali yang didasarkan pada pengetahuan yang mendalam. Sifat-sifat pelarut pengembang juga merupakan faktor dominan dalam penentuan mobilitas komponen-komponen campuran. Umumnya, kemampuan suatu pelarut pengembang untuk menggerakkan senyawa pada suatu adsorben berhubungan dengan polaritas pelarut[6].

C. Uraian Tanaman
1. Klasifikasi Ketela Pohon[7] 
Regnum : Plantae
Divisi : Spermatophyta
Subdivisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledoneae
Bangsa : Euphorbiales
Famili : Euphorbiaceae
Genus : Manihot
Spesies : Manihot utilissima Pohl.

2. Deskripsi
Batang tanaman ubi kayu berkayu, beruas-ruas, dan panjang, yang ketinggiannya dapat mencapai 3 meter lebih. Warna batang bervariasi, tergantung kulit luar, tetapi batang yang masih muda umunya berwarna hijau dan setelah tua menjadi keputih-putihan, kelabu, hijau kelabu, atau coklat kelabu. Empulur batang berwarna putih, lunak, dan strukturnya empuk seperti gabus. Daun ubi kayu mempunyai susunan berurat menjari dengan canggap 5-9 helai. Daun ubi kayu biasanya mengandung racun asam sianida atau asam biru, terutama daun yang masih muda (pucuk). Tanaman ubi kayu dapat beradaptasi luas di daerah beriklim panas (tropis)[7].

D. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • a. Batang pengaduk
  • b. Hot plate
  • c. Erlenmeyer 500 ml
  • d. Erlenmeyer 1000 ml
  • e. Corong
  • f. Rabung reaksi
  • g. Spatula
  • h. Plat KLT
  • i. Pipet kapiler
  • j. Gelas kimia
  • k. Waterbath
  • l. Corong pisah 250 ml
  • m. Cawan porselen
  • n. Lampu UV-Vis
  • o. Oven

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu: 
  • a. Akuades 
  • b. Serbuk daun singkong kering 100 gram
  • c. Etanol 96%
  • d. HCl 2 N
  • e. n-heksan
  • f. Aluminium foil
  • g. Dietil eter
  • h. Metanol 
  • i. Na2SO4¬
  • j. Kapas
  • k. Kertas saring

E. Prosedur Kerja
LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)



F. Hasil Pengamatan
LAPORAN ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)

G. Pembahasan
Isolasi senyawa kimia dari bahan alam adalah sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni. Tanaman mengandung ribuan senyawa yang dikategorikan sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami ini mentargetkan untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia. Sehingga praktikum kali ini dilakukan untuk mengisolasi rutin (flavonoid-3-glikosida) sebagai salah satu jenis glikosida flavonoid (glikosida flavonol) yang terkandung dalam daun singkong/ketela pohon.

Tanaman singkong berasal dari Brazilia tetapi sekarang sudah tersebar hampir di seluruh dunia. Indonesia termasuk salah satu negara penghasil singkong utama dunia setelah Brazilia dan Zaire. Tanaman Singkong banyak di tanam di daerah-daerah berlahan kering dengan sistem pengairan yang hanya mengandalkan air hujan. Tanaman singkong dapat diolah sebagai bahan makanan, dan daunnya dibuat sayuran, tetapi untuk pengobatan masih jarang digunakan. Salah satu senyawa yang terkandung di dalam daun singkong adalah flavonoid rutin. Rutin merupakan senyawa turunan dari flavonoid. 

Glikosida adalah senyawa yang menghasilkan satu atau lebih gula dan komponen bukan gula pada reaksi hidrolisis. Glikosida terdiri atas gabungan dua bagian senyawa, yaitu gula (glikon) dan bukan gula (aglikon atau genin).Kedua bagian senyawa tersebut dihubungkan oleh suatu ikatan berupa jembatan oksigen (O-glikosida, dioksin), jembatan nitrogen (N-glikosida, adenosin), jembatan sulfur

(S-glikosida, sinigrin), maupun jembatan karbon (C-glikosida, barbaloin). Berdasarkan strukturnya, flavonoid merupakan senyawa induk flavon yang terdapat berupa tepung putih pada tumbuhan Primula, dan semuanya mempunyai sejumlah sifat yang sama. Saat ini dikenal sekitar 20 jenis flavonoid, yang berupa senyawa yang larut dalam air. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambahkan basa atau amoniak, sehingga flavonoid mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan.

Glikosida flavonoid termasuk rutin merupakan salah satu metabolit sekunder yang bersifat polar, termasuk kedalam kelompok glikosida O (molekul gula berikatan dengan O-aglikon). Rutin daun singkong (satu zat aktif) sebagai bahan obat-obatan dan kosmetik, serta jadi zat pengatur tumbuh tanaman. Karena sifatnya yang polar maka pengisolasian rutin dilakukan dengan penggunaan pelarut polar yaitu air, dengan penggunaan air yang kemudian dipanaskan membuat semua senyawa polar tertarik bersama filtrate. Hal ini merupakan salah satu kerugian penggunaan air sebagai pelarut karena, banyak sekali komponen-komponen polar yang dapat larut bersama air. Sehingga metode yang digunakan yaitu metode infundasi. 

Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya digunakan untuk menyari zat kandungan zat aktif yang larut dalam air dan bahan-bahan nabati. Penyarian dengan cara ini menghasilkan sari yang tidak stabil dan mudah tercemar oleh kuman dan kapang. Oleh karena itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24 jam. Digunakan metode infundasi karena proses cepat serta pelarut yang digunakan adalah air yang bersifat polar. Setelah dilarutkan menggunakan air yang dipanaskan, selanjutnya dilakukan proses pemisahan antara filtrat dan residu tanaman singkong.

Filtrat yang diperoleh kemudian disimpan dalam lemari pendingin untuk mempercepat pembentukan kristal rutin dan mencegah terjadinya penjamuran. Karena media air yang digunakan memungkinkan timbulnya jamur atau bakteri jika disimpan di suhu ruang. Endapan yang diperoleh disaring dan dicuci dengan menggunakan etanol dingin dengan tujuan agar kemurnian filtrat menjadi bertambah dan terbebas dari pengotor-pengotor yang tidak ingin diisolasi, namun tidak menyebabkan kristal yang dicuci menjadi larut. 

Kristal yang diperoleh disaring dan dikeringkan menggunakan oven selama 3 jam. Setelah kering, dilakukan uji titik leleh untuk membandingkan titik leleh rutin yang telah ada pada literatur dengan rutin yang diperoleh pada saat praktikum. Ketika memiliki titik leleh yang sama, hal ini menyatakan bahwa percobaan untuk mendapatkan isolasi glikosida flavonoid ini berhasil. Titik leleh pada instrumen di atur pada 330oC – 360 oC. Pada saat dilakukan pengukuran di uji titik lelehnya menggunakan alat automatic melting point, hasil dari pengukuran titik leleh dari kristal sampel yang diperolah tidak sesuai dengan literatur yaitu sekitar 242oC. Hasil yang kami peroleh yaitu 342,9 oC serta tidak menunjukkan pergerakan dari rutin menggambarkan kristalnya yang telah meleleh. Hal ini dapat dilihat dari perubahan warna bahan menjadi hitam saat diukur titik lelehnya dan pada isolat juga menunjukkan secara organoleptik berwarna hijau. Seharusnya isolat rutin berwarna kuning. 

Hal ini bisa terjadi karena kesalahan pada saat preparasi sampel yang seharusnya dicuci oleh metanol dingin yang dicampur dengan air dingin. Karena rutin dapat terbentuk pada suhu rendah dan salah satunya adalah kurangnya ketelitian dari praktikan.

H. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
  1. Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar, sehingga dapat diekstraksi dengan pelatur polar, seperti air, metanol atau etanol. Filtrat yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk mempercepat pembentukan kristal. Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. 
  2. Analisa dari aglikon dan glikosida ini dapat dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis tipis, dan menggunakan eluen tertentu sesuai dengan kepolaran senyawa yang dianalisa. 

DAFTAR PUSTAKA
[1] Meilawaty, Z., 2013, Efek Ekstrak Daun Singkong (Manihot utilissima) terhadap Ekspresi COX-2 pada Monosit yang Dipapar LPS E. Coli, Dental Journal Majalah Kedokteran Gigi, Vol. 40 (4). 

[2] Pambudi, A., Syaefudin, Nita N., Risa S., Purwanty R.A., 2014, Identifikasi Bioaktif Golongan Flavonoid Tanaman Anting-Anting (Acalypha indica L.), Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi, Vol. 2 (3).

[3] Putra, R.T., Yani L., Reza A.K., 2015, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dalam Tumbuhan Lamun Cymodocea rotundata Ehrenberg & Hemprich Ex Ascherson, Prosiding Penelitian SPeSIA Unisba (Kesehatan dan Farmasi), Farmasi Gelombang 2.

[4] Daniatik, Suwijoyo P.,Sugeng R., 2015, Penentuan Kadar Flavonoid Total Fraksi Etil Asetat dan Fraksi Kloroform Hasil Hidrolisis Ekstrak Etanolik Daun Kepel (Stelechocarpus burahol (BL) Hook f. & Th.) dengan Metode Spektrofotometr Menggunakan Rutin sebagai Pembanding, Kartika Jurnal Ilmiah Farmasi, Vol. 3 (1). 

[5] Pasaribu, S.P., Erwin, Putri I., 2014, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid dari Daun Tumbuhan Kerehau (Callicarpa longifolia Lam.), Jurnal Kimia Kemahasiswaan, Vol. 11 (2).

[6] Atun, S., 2014, Metode Isolasi dan Identifikasi Struktur Senyawa Organik Bahan Alam, Jurnal Konservasi Cagar Budaya Borobudur, Vol. 8 (2).

[7] Thamrin, M., Ainul M., Samsul Em., 2013, Analisis Usahatani Ubi Kayu (Manihot utilissima), Agrium, Vol. 18 (1).