MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS - ElrinAlria
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
BAB I
PENDAHULUAN

A. Rumusan Masalah
Rumusan masalah yang diangkat dalam makalah ini ialah sebagai berikut :
  1. Apa yang dimaksud dengan pengukuran interaksi obat-reseptor? 
  2. Bagaimana prinsip studi pengikatan biokimia? 
  3. Bagaimana prinsip studi fungsional? 
  4. Apa yang dimaksud dengan pengukuran respon obat? 
  5. Apa yang dimaksud dengan respon dan efek sementara? 

B. Tujuan
Adapun tujuan dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut :
  1. Untuk mengetahui prinsip pengukuran interaksi obat-reseptor. 
  2. Untuk mengetahui tentang studi pengikatan biokimia. 
  3. Untuk mengetahui tentang studi fungsional 
  4. Untuk mengetahui prinsip pengukuran respon obat 
  5. Untuk mengetahui tentang respon dan efek sementara obat 

C. Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dalam penulisan makalah ini adalah sebagai berikut:
  1. Mahasiswa dapat mengetahui prinsip pengukuran interaksi obat-reseptor. 
  2. Mahasiswa dapat mengetahui mengetahui tentang studi pengikatan biokimia. 
  3. Mahasiswa dapat mengetahui tentang studi fungsional. 
  4. Mahasiswa dapat mengetahui prinsip pengukuran respon obat. 
  5. Mahasiswa dapat mengetahui tentang respon dan efek sementara obat. 

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengukuran Interaksi Obat-Reseptor
Jelas bahwa informasi relevan tentang obat-obatan dan reseptor akan didapatkan dari monitoring interaksi antara keduanya. Umumnya, terdapat dua pendekatan percobaan besar yang digunakan untuk ini, khususnya, pengukuran pengikatan obat dengan populasi reseptor (Studi pengikatan biokimia) dan pengukuran respon seluler (atau subseluler) yang dihasilkan dari interaksi obat dengan reseptor (studi fungsional). Studi pengikatan biokimia berkonsentrasi pada kelakuan populasi total dari reseptor, sedangkan, studi fungsional dapat meninjau populasi parsial (sebagian) (gambar 7.1). Ini baik untuk mempertimbangkan keuntungan dan kerugian relatif dari kedua pendekatan tersebut.

Gambar 7-2A menunjukkan kurva dari pengikatan ligand pada tiga populasi reseptor. Populasi reseptor 1 yang paling sensitif pada ligand, tapi hanya ada sedikit reseptor dibanding dua lainnya.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar tersebut juga menunjukkan kurva pengikatan individual pada masing-masing tiga populasi reseptor sama halnya untuk kurva pengikatan total terhadap semua reseptor. Hal tersebut bisa dilihat pada gambar ini.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-2. Interaksi antara ligan dengan tiga populasi reseptor yang berbeda. A. ligand terikat pada tiga populasi dengan afinitas berbeda. Terlihat bahwa yang paling kuat adalah populasi 1, namun populasi ini mengandung lebih sedikit jumlah reseptor dibanding dua populasi lainnya. B. lingkaran menunjukkan ukuran relatif dari tiga populasi reseptor dan interaksi relatif dari berbagai konsentrasi ligan (dalam lingkaran tergelap) dengan setiap populasi. Panel menunjukkan konsentrasi ligan paling rendah, yang hampir berinteraksi ekslusif dengan populasi 1. Konsentrasi ligan meningkat (panel b-e), interaksi ligan keluar ke arah populasi reseptor lainnya. C. jumlah reseptor terikat ditunjukkan dalam kurva garis padat. Presentase pengikatan pada populasi 1 ditunjukkan dalam kurva garis putus-putus. Konsentrasi ligan meningkat, persen relatif pengikatan hanya pada populasi 1 menurun.

yang mengingatkan bahwa konsentrasi rendah ligan terutama mengikat pada reseptor populasi 1, konsentrasi yang lebih tinggi keluar ke populasi reseptor lainnya. Selain itu, pada saat ini terjadi, karena populasi reseptor lainnya (populasi 2 dan 3) lebih besar dibanding reseptor 1, semakin banyak ligan yang ditambahkan, semakin banyak pengikatan yang terjadi pada kedua populasi tersebut dibandingkan pada populasi utama. Pengikatan relatif dari konsentrasi tertentu dari ligan (ditunjukkan oleh lingkaran tergelap) pada tiga populasi reseptor ditunjukkan pada gambar 7-2B. tidak hanya konsentrasi ligan yang lebih besar yang mengikat pada populasi reseptor 2 dan 3, tapi juga pusat lingkaran tergelap berpindah, menunjukkan bahwa selektifitas ligan untuk reseptor 1 hilang pada konsentrasi yang lebih tinggi.

Gambar 7-2C menunjukkan fraksi yang berkurang dari total reseptor sehubungan dengan populasi reseptor 1 dengan peningkatan konsentrasi ligan. Umumnya, ini menggambarkan kesulitan dalam menahan spesifitas efek obat dengan studi pengikatan. Ligan harus sangat luar biasa selektif untuk mencapai total pengikatan dengan populasi reseptor tanpa berinteraksi dengan tempat lain. Dalam hal ini, studi tentang populasi parsial reseptor memiliki keuntungan. Meski demikian, studi pengikatan dapat melengkapi data tidak ternilai tentang stoikiometri interaksi obat-reseptor dan sifat jenis yang dibentuk. Selain itu, kompleks obat-reseptor dapat dipelajari secara langsung, dengan menginterpretasikan bentuk kurva pengikatan pada kondisi molekular.

B. Studi Pengikatan Biokimia
Sebagian besar informasi tentang interaksi obat-reseptor bisa diperoleh dari studi jumlah dan cara pengikatan obat berlabel radio dengan reseptor. Umumnya, konsentrasi tertentu obat berlabel radio seimbang dengan preparasi yang mengandung reseptor (yaitu sel utuh, fragmen sel membran) untuk periode waktu yang telah ditentukan (cukup bagi reseptor dan obat untuk saling berikatan dalam jumlah sama dengan satu sama lain). Selanjutnya, preparasi reseptor secara fisik diisolasi dan aktifitas radio (radio aktif) diukur. Besarnya sinyal radioaktif berbanding lurus dengan jumlah ikatan obat pada reseptor dan, karena konsentrasi obat diketahui, kurva respon-dosis dari pengikatan tersebut dapat diperoleh (Gambar 7-3). Obat yang paling radiolabel berikatan pada tempat lainnya dalam membran di samping reseptor tersebut (disebut ikatan non spesifik); oleh karena itu, eksperimen paralel dijalankan pada obat yang diketahui berikatan dengan reseptor hadir dalam sebuah konsentrasi akan melindungi populasi reseptor dari penandaan radiolabel. Jika radioaktif dari pengikatan non spesifik ini disubstratkan dari jumlah total pengikatan (reseptor ditambah tempat non spesifik), hasilnya radioaktif hanya berhubungan dengan populasi reseptor.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-3.Skema diagram dari proses pengikatan radio ligan. Eksperimen parallel dioperasikan, satu dengan radio ligan yang melibatkan inkubasi preparasi reseptor dengan radioligan dan satunya lagi radiologand dengan adanya konsentrasi penuh dari -nonaktif- reseptor ligan aktif yang akan melindungi reseptor saja dari pengikatan dengan radioligan. Dua kurva menunjukkan kembali dua hasil dari proses ini yang diulang dengan jarak konsentrasi radioligan. Pengurangan kedua kurva menghasilkan sejumlah radio ligan yang berikatan hanya dengan reseptor (pengikatan spesifik; bawah kurva)

Pengikatan radio ligan pada tempat populasi ikatan non spesifik (nsb) yang besar dari campuran asal dapat diperkirakan dengan garis hubungan antara konsentrasi radioligan dan jumlah ikatan nonspesifik:
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
Total pengikatan radioligand pada populasi reseptor terdefinisi (di mana pengikatan berupa ikatan jenuh) dan banyak populasi besar dari tempat nonreseptor lainnya (ikatan no-spesifik) dapat dimodelkan oleh suatu penjumlahan adsorpsi isoterm `Langmuir` dan model linear ikatan non-spesifik:
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
Cara yang akurat untuk mencapai hal ini adalah mencocokkan kurva pengikatan total dan pengikatan non-spesifik (ditentukan secara terpisah) secara serempak pada persamaan 7.2 dan 7.3, berturut-turut. Dalam keadaan asimtot (garis lurus mendekati kurva) maksimal untuk pengikatan reseptor (B max) dan sensitifitas preparasi reseptor pada radioligand (Kd‘ konstanta keseimbangan disosiasi kompleks reseptor radioligan) dapat diperkirakan secara matematis dan dibandingkan dengan model reseptor.

Salah satu pertimbangan studi pengikatan adalah persyaratan bahwa proses pengikatan tidak mengubah konsentrasi bebas ligan (Lihat Bab 5). Untuk memastikan ini, pengikatan konsentrasi tertentu ligan diukur pada berbagai jumlah material reseptor (biasanya membran sel yang mengandung reseptor). Saat jumlah reseptor menjadi cukup besar untuk mengimbangi jumlah radioligand, jumlah yang terikat mencapai batas. Ini digambarkan dengan kelengkungan kurva pengikatan konsentrasi untuk meningkatkan jumlah reseptor (Fig 7-4A). Catat bahwa daerahdi mana pengikatan mengubah konsentrasi bebas radioligan, percobaan harus dilakukan di daerah linier kurva (Fig 7-4A).
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7-4. Keseimbangan kondisi untuk studi pengikatan.
  • A. efek dari peningkatan konsentrasi reseptor pada produksi kompleks antara reseptor dan radioligand. Saat konsentrasi reseptor meningkat, pengikatan mengimbangi jumlah radiologand bebas sampai terjadi saturasi (yaitu tida ada radioligand lainnya dalam medium untuk melakukan pengikatan dan tidak ada kompleks reseptor-ligan yang terbentuk). Untuk penilaian akurat dari parameter dan penggunaan model reseptor, sinyal dan konsentrasi reseptor harus dijaga tetap berada di bagian linier kurva ini (di dalam area persegi). 
  • B. kinetika keseimbangan radioligan dengan reseptor. Percobaan harus dilakukan setelah keadaan stabil telah dicapai (kesetimbangan dataran tinggi). Selain itu, pengikatan harus bersifat reversibel bahwa ketika dicuci dengan medium bebas obat, radioligand harus terbebas dari reseptor. 

Pertimbangan lain dalam studi pengikatan adalah bahwa pengikatan mengacu pada kinetika orde pertama. Dengan demikian, pengikatan harus mencapai maksimum dengan meningkatkan waktu dan reversibel pada pencucian dengan media bebas obat (Fig 7-4B). Karena eksperimen pengikatan dilakukan pada waktu “stop-tim” (vide infra), preparasi reseptor harus berimbang dengan ligan untuk jangka waktu yang cukup untuk mencapai keseimbangan (Fig 7-4B).

Jumlah total radioligand yang terikat pada preparasi yang bisa digantikan oleh ligan pelindung spesifik untuk populasi reseptor menentukan pengikatan spesifik pada preparasi (yaitu, jumlah relative pengikatan total reseptor). Untuk beberapa pengikut radioligan (atau beberapa reseptor pengikut spesifik preparasi membran), pengikatan non-spesifik mungkin sangat tinggi sehingga mendefinisikan jumlah yang relatif kecil pada sinyal reseptor (Fig 7-5A). Dalam keadaan ini, definisi jelas dari peristiwa pengikatan reseptor, sulit dan tunduk pada kesalahan Statistik. Namun, beberapa ligan sangat selektif untuk reseptor dibanding tempat non-spesifik, dan pengikatan non-spesifik sangat rendah. Dalam keadaan ini, sebagian besar sinyal bisa dihubungkan dengan reseptor (Fig 7-5B). Secara umum, kondisi eksperimental harus dioptimalkan untuk pengikatan spesifik maksimum.

Seperti telah dibahas sebelumnya, pengukuran langsung dari jumlah kompleks yang terbentuk antara obat dan reseptornya memungkinkan bentuk kurva dosis-respon diinterpretasikan pada kondisi molekular. Secara umum, Semua analisis ini membandingkan pengikatan yang diobservasi pada model adsorpsi isotherm Langmuir (Lihat Bab 3) untuk pengikatan ligan tunggal ke tempat populasi tunggal yang serupa. Penyimpangan dari model ini dapat diinterpretasikan pada keadaan multisite populasi atau multistate populasi, dimana oleh reseptor diubah ke entitas lain dalam pengikatan. Ketajaman penyimpangan dari model sederhana ini dapat sangat dibantu oleh Statistik.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


C. Studi Fungsional
-Tipe-tipe Respon Obat
Sistem kehidupan biologis biasanya memiliki indikator karakteristik pada keadaan fisiologis (misalnya, tingkat dasar metabolisme, tekanan ion hydrogen, nada tekanan otot). Respon biologis dapat diukur setelah indikator fisiologis yang sesuai telah teridentifikasi. Ada dua persyaratan dasar untuk faktor ini:
  1. Rasio signal-to-noise harus cukup untuk membedakan perubahan induksi obat, dan 
  2. Aktivitas dasar harus stabil untuk memungkinkan pengukuran perubahan. 
Besaran nyata dari respons obat, dengan asumsi bahwa sensitivitas dari alat-alat pengukur cukup untuk mendeteksi sinyal, tidak hampir sepenting hubungannya dengan keributan acak dari preparasi. Kebutuhan awal yang dihadapi adalah stabilitas dasar dari sistem reseptor.

-Stabilitas Sistem
Secara umum, pengukuran respon biologis obat memerlukan sistem reseptor yang kompleks untuk mengenal obat dan menerjemahkan informasi dan sistem transduksi untuk memperkuat stimulus dan menghasilkan sinyal yang terukur. Seringkali, proses ini kemudian melibatkan tambahan proses dasar yang berkelanjutan dalam sel. Sebagai contoh, second messenger, AMP siklik, hadir dalam sitosol sebagai hasil dari fungsi dasar adenilat silase.

Demikian pula, tujuh reseptor transmembran ada dalam populasi parsial yang secara spontan aktif dan dengan demikian menghasilkan aktivitas biologis dasar tingkat rendah. Secara umum, percobaan biologis memiliki jendela karakteristik stabilitas dan kelangsungan hidup kedua sisi yang tidak cocok untuk data terpercaya. Sering preparasi dari sistem in-vitro (misalnya, penempatan kultur sel, pembedahan jaringan terisolasi) mengalami trauma dan menghasilkan aktivitas dasar dari sistem yang tidak sesuai, tidak stabil dan bervariasi. Dengan demikian, untuk mencapai stabilitas, suatu periode seimbang harus dilakukan sebelum percobaan (Fig 7-6). Preparasi bervariasi dalam panjang waktu mereka tetap stabil, tetapi perbedaan pasti antara kondisi alami dan kondisi in vitro akan mengarah ke kemerosotan fungsi. Tingkat dari kemerosotan juga dapat tersedia, oleh karena itu data yang diambil pada periode ini tidak valid.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Prinsip percobaan independen dalam preparasi reseptor yang berbeda adalah bahwa sensitivitas dan kemampuan bereaksi dari sistem biologis tidak berubah sepanjang masa percobaan. Sering sulit untuk memperoleh data untuk mendukung asumsi ini, sehingga hal ini harus diterima tanpa kualifikasi. Ada dua pendekatan yang luas digunakan mengurangi potensi kesalahan untuk sistem ketidakstabilan. Pertama adalah "membenarkan" perubahan fungsi dasarl dalam eksperimen. Sebagai contoh, jika pada keadaan istirahat preparasi dapat disimpulkan dari respon garis dasar dalam ketiadaan obat, maka penyimpangan pada garis dasar dapat diekstrapolasi dan diasumsikan dalam perhitungan respon obat. Jika penyimpangan ini berupa garis linier, maka akan lebih mudah diprediksi dibanding jika pengamatan yang biasanya lebih sering dilakukan pada kemerosotan hyperbolic garis baseline sering diamati dari baseline (Gambar 7-7).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7.7. Pengaruh perpindahan baseline pada kurva. Baselines dapat menurun secara monoton (garis lurus, tracing atas) atau eksponensial (tracing yang lebih rendah). Jika kurva dosis-respon diperoleh dari pergerakan baseline ini, kurva yang menunjukkan A ke D akan muncul. Kurva dosis-respon bawah adalah kurva yang diperoleh secara eksperimental dibandingkan dengan kurva yang sebenarnya (yaitu, tidak ada baseline yang menghilang). Seperti dapat dilihat dari gambar ini, pemudaran awal eksponensial menghasilkan kesalahan yang paling menonjol. Seacra umum, pemudaran baseline mempengaruhi asimtot maksimal tetapi tidak pada lokasi parameter kurva respon-dosis.

Tipe kedua dari pengoreksian adalah melalui preparasi eksperimen sekunder "kontrol" dimana tidak ada perlakuan obat yang diperoleh dan hanya fungsi dasar yang dipantau. Ini mungkin lebih berbahaya dibanding pengoreksian intraeksperimental sebagai variabilitas antara dua preparasi berbeda yang disatukan. Ini bisa serius karena preparasi yang berbeda mungkin memburuk pada tingkat yang sangat berbeda. Sebagai contoh, dapat diasumsikan bahwa dalam sistem biologis yang terdiri dari kumpulan sel (kultur sel), setelah periode kelangsungan hidup, beberapa sel tua mulai mati dan tingkat keseluruhan kematian sel berupa eksponensial (p = e-k di mana k adalah konstanta laju kematian sel dan p adalah fraksi dari sel-sel hidup yang tersisa). Asumsikan perbedaan dalam ketergantungan total sistem kemampuan merespon terhadap obat pada jumlah sel yang hidup (yaitu satu kultur mungkin lebih efisien dipasangkan dibanding yang lain atau mungkin memiliki perbedaan jumlah dalam reseptor yang diekspresikan), perbedaan sangat kecil dalam k dapat menyebabkan perubahan yang berbeda dalam sensitivitas obat dalam dua preparasi independen. Efek yang diprediksi dari eksponensial kematian sel pada kurva dosis-respon ditunjukkan pada Gambar 7-8. Hubungan kompleks tertentu antara kelangsungan hidup sel dan potensi agonis, tidak mungkin bahwa satu sistem akan menjadi kontrol yang baik untuk perubahan dalam kemampuan merespon dasar antara jaringan. Seacra umum, data yang paling valid diperoleh dari sistem stabilitas yang dikenal dan semua data harus dikumpulkan dengan baik di dalam jendela stabilitas.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7.8. Pengaruh eksponensial kematian sel dalam kurva dosis-respon pada agonis A. Percent sel yang hidup dalam waktu percobaan dalam preparasi biologis. Garis putus-putus atas mengacu pada jumlah minimal sel diperlukan untuk menghasilkan respon maksimal terhadap agonis. Garis putus-putus bawah menunjukkan jumlah minimal sel yang dibutuhkan untuk meghasilkan beberapa respon terhadap agonis B. kurva dosis-respon terhadap agonis dengan peningkatan waktu. Secara umum, jaringan kehilangan sensitivitas (seperti yang ditunjukkan oleh pergeseran ke kanan dari dosis-respon kurva), diikuti dengan hilangnya respon maksimal.

Semua preparasi reseptor fungsional memiliki jendela kemampuan respon tertentu -yaitu, jarak konsentrasi obat dimana respon terutama mengarah pada aktivasi populasi reseptor tunggal dan respon dihasilkan karena hanya untuk aktivasi populasi itu. Ketika rentang konsentrasi ini telah lewat, efek sekunder dari obat akan teramati. Dalam banyak contoh, efek sekunder tersebut dapat divisualisasikan dengan perubahan nyata di slope atau asimtot maksimal pada kurva respon-dosis (gambar 7-9). Dalam kasus lain, perubahan dalam bentuk kurva mungkin menunjukkan efek sekunder: gambar 7-10A menunjukkan serangkaian kurva respon-dosis terhadap agonis yang mengaktifkan mekanisme secondary respon pada konsentrasi melebihi 20 unit. Dalam hal ini, intervensi selektif untuk reseptor yang menarik perhatian yang mengerakkan kurva respon-dosis ke konsentrasi yang lebih tinggi tersebut (seperti reseptor antagonisme atau hilangnya sensitivitas biologis sistem untuk reseptor stimulasi) mendorong kurva terhadap dinding luar yang mana kurva menunjukkan kemiringan meningkat dan hilangnya bentuk sigmoidal yang menunjukkan aktivasi reseptor tunggal (gambar 7–10B).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


-Pengujian Fungsional Obat-Reseptor
Farmakologi penuh dengan wawasan penggunaan jaringan terisolasi untuk mengukur efek obat. Untuk sebagian besar, penggunaan sistem ini telah berguna dimana ini adalah satu-satunya pengujian yang tersedia di tahun-tahun awal untuk menaksirkan respons biologis. Namun, ketika teknologi telah memungkinkan, aliran respon stimulus telah dipotong sampai, saat ini, ada banyak poin sepanjang banyak aliran tersebut yang dapat digunakan sebagai ukuran efek obat.

Namun, prinsip dasar amplifikasi biologis -komplikasi dengan tanggapan untuk merespon diri sendiri –sekalipun pembatalan- member kesan bahwa sistem selular dengan respon pembacaan respon organ terakhir dapat menjadi sangat berharga. Sebagai contoh, meskipun jenis sel yang berbeda menghasilkan respon yang berbeda terhadap obat, tergantung pada penampilan dan lokasi mereka, semua sel mengatur respirasi sebagai fungsi biologis dasar. Salah satu hasil dari pengaturan ini adalah tekanan ion hidrogen. Dengan demikian, sebagai metabolisme dari perubahan sel, demikian juga laju di mana sel menekan ion hidrogen dalam upaya untuk menjaga keseimbangan pH (Gambar 7-11); Hal ini dapat diukur sebagai respon. Keuntungan dari sistem ini adalah bahwa hal ini umum untuk semua sel, dan karena itu, setiap kultur sel secara teoritis dapat menghasilkan respons biologis di bawah kondisi tersebut (2).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Terdapat pengujian fungsional lain yang bergantung pada sel-sel khusus untuk menunjukkan perubahan pada tingkat second messenger. Salah satunya adalah katak melanophore. Sel-sel ini meniadakan pigmentasi dengan meningkatan kadar AMP siklik dan memusatkan pigmen dalam respon terhadap berbagai agoni. Oleh karena itu, perubahan pada pigmentasi, yang dapat dilihat langsung oleh transmisi cahaya, dapat digunakan untuk memantau perubahan pada mediator tingkat sitosol yang, pada gilirannya, dapat dikendalikan oleh reseptor. Oleh karena itu, obat yang mengubah kadar AMP siklik atau second messenger lain menghasilkan perubahan pada pigmentasi, respon fungsional dapat diukur dan digunakan untuk mengukur efek obat. Metodologi ini dapat dibuat menjadi lebih kuat dengan menggunakan sel-sel ini sebagai host untuk memperlihatkan reseptor manusia secara genetik. Pada keadaan seperti itu, reseptor dapat diperkenalkan ke dalam respon penandaan sel (lihat bab 2), dan uji fungsional untuk reseptor tersebut yang dapat dibuat.

Masih tipe lain dari uji fungsional dapat dibuat dengan memperkenalkan substansi "reporter" ke dalam sel. Ini mengubah keadaan mereka dengan mengubah tingkat dari sitosol mesengger. Sebagai contoh, protein fluorescent, yang menghasilkan pendar dengan peningkatan kadar AMP siklik, dapat diperkenalkan ke dalam sel. Ketika obat mengaktifkan reseptor untuk meningkatkan AMP siklik, sel-sel fluoresensi, sebuah respon yang dapat diukur secara fotometrik. Variasi lainnya dalam pendekatan ini mengenalkan protein sensitif kalsium, seperti aequorin, yang menghasilkan cahaya pada elevasi sitosol Ca2+.

D. Pengukuran Respon Obat
Secara umum, respon obat diukur sebagai perubahan keadaan (ini dapat menjadi suatu nilai atau produk) dari keadaan dasar ke beberapa keadaan tetap (atau keadaan pada titik waktu yang berubah-ubah) yang diperoleh dengan adanya obat. Pada dasarnya ada dua titik acuan yang dibutuhkan untuk menilai status dari respon obat: keadaan dasar dengan tidak adanya obat dan respon maksimal sistem ini mampu menghasilkan respon untuk stimulus yang sama. Keadaan dasar selalu diamati, tapi respon maksimal dapat menimbulkan masalah. Ada beberapa transformasi yang digunakan untuk variabel terikat-obat (seperti respon); ini ditunjukkan pada Gambar 7-12A. Jelas, yang pertama adalah respon kasar. Penggunaan parameter ini berbahaya karena tidak mengimbangi besarnya salah satu titik referensi (yaitu, keadaan dasar atau respon maksimum). Oleh karena itu, variasi dalam besarnya ini tercermin sebagai variasi dalam respon obat, dengan bersamaan hilangnya akurasi. Teknik lain yang paling umum adalah dengan menggunakan perbedaan dalam keadaan sistem pada ketiadaan dan kehadiran obat (Δ Respon pada Gambar 7-12B). Hal Ini memiliki keuntungan dalam membatalkan perbedaan pada efek dasar.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Setelah indikator respon dipilih, terdapat sejumlah metode untuk menyatakan kuantifikasi. Jelasnya, yang paling mudah akan digunakan sebagai pembacaan respon yang benar. Masalah utama dengan pendekatan ini adalah variasi dalam aktivitas dasar pada lebih dari satu preparasi yang ditambahkan ke dalam besarnya respon obat, dengan demikian menambah kesalahan. Efek dalam variasi respon dapat diminimalkan dengan replikasi. Gambar 7-13 menunjukkan aktivitas biologis dari sistem hipotetis. Aktivitas dasar, kepekaan terhadap obat-obatan, dan kemampuan respon maksimum obat diperlakukan menjadi suara acak oleh komputer untuk 40 preparat yang berbeda (tujuh konsentrasi obat, menghasilkan 280 respon acak). Respon yang dihasilkan secara acak bercampur lebih lanjut seperti tidak ada korelasi antara respon dengan dosis berturut-turut. Dalam keadaan ini, skenario di mana hanya satu respon terhadap satu konsentrasi dapat diukur untuk preparat tertentu yang telah diproduksi dengan demikian membolehkan pembuatan kurva respon dosis dari sejumlah preparat acak.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


Seperti yang diharapkan, jika hanya satu kurva dosis-respon yang tepasang seperti demikian, terdapat derajat tinggi dari variabilitas dan representasi yang buruk dari respon rata-rata (Gambar 7-14A). Jika proses ini diulang, bagaimanapun, dan kurva dosis-respon yang dihasilkan rata-rata, representasi yang lebih akurat dari kurva sebenarnya telah diperoleh. Gambar 7-14B menunjukkan rata-rata dari kurva berturut-turut diperoleh dengan cara ini. Hal ini dapat dilihat pada tingkat variabilitas, layaknya kurva akurat diperoleh dengan rata-rata 15 sampai 20 replikasi. Standar kesalahan dari rata-rata respon mendistribusikan sepanjang konsentrasi dalam mode homogen, disebut sebagai kesalahan homeoscedastic (Gambar 7-14C).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


Gambar 7-14. Respon langsung diplot sebagai fungsi konsentrasi log. A. Tujuh respon acak dari kolam yang dipilih dan diplot sebagai kurva respon dosis-tunggal (tujuh respon datang dari preparat biologis yang berbeda). Ini mensimulasikan kondisi di mana hanya pada respon per preparat yang dapat diperoleh. Kurva dosis-respon tentu harus dibuat dengan data dari jaringan yang berbeda. Standard kesalahan untuk rata-rata atau Standard Error for Mean (SEM) kurva dibuat dengan cara ini tidak tergantung pada dosis obat. B. Empat puluh seperti kurva dosis-respons yang dipilih oleh komputer dan berurutan rata-rata (yaitu, lima puluh kurva menunjukkan lima kurva, kesepuluh kurva adalah rata-rata dari sepuluh kurva, dan sebagainya). Oleh waktu 20 kurva merupakan hasil relatif rata-rata kurva halus. C. Standar kesalahan menurun dengan rata-rata jumlah kurva.

Seperti telah dibahas sebelumnya, pengurangan dalam kesalahan dari pengukuran respon dapat dicapai dengan menghilangkan varians dalam respon dasar dengan mengurangi respon dasar dari respon induksi obat. Ini hanya meningkat aktivitas biologis untuk obat (Gambar 7-15A). Gambar 7-15B menunjukkan hasil pengubahan pada data yang dihasilkan secara acak dari Figur 7-14B. Jelas, karena respon dasar secara artifisial berkurang ke nol, variasi dalam kurva minimal pada permulaan dan meningkat dengan dosis obat. Ini menunjukkan heterogenitas dalam kesalahan, peningkatan sebagai besarnya respon meningkat (kesalahan heteroscedastic; Gambar 7-15C). Transformasi tidak mengurangi kesalahan dengan beberapa replikasi.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-15. Respon delta yang dihitung dari dataset ditunjukkan pada Gambar 7-14. A. perbedaan antara respon dasar dan respon obat masa stabil diplot sebagai fungsi dari konsentrasi log. Kesalahan berkisar dari nol di ambang dari kurva dosis-respons untuk nilai maksimal pada maksimal asimtot. B. Empat puluh simulasi kurva (seperti untuk Fig 7-14B). C Standar Error of the Means (SEM) untuk kurva rata-rata. Perhatikan ketergantungan kesalahan pada konsentrasi dan nilai kesalahan yang tinggi tidak terkendali pada asimtot maksimal ketika beberapa kurva dosis-respon dirata-ratakan

Sebuah metode alternatif untuk mengurangi dampak dari variasi awal adalah menunjukkan respon sebagai persentase dari tingkat dasar. Gambar 7-16A menunjukkan efek dari perubahan pada data yang dihasilkan secara acak. Pada umumnya, kecenderungan dengan pendekatan ini mirip dengan yang diperoleh dengan pengurangan respon dasar (Gambar 7-15A), tetapi variasi bisa jauh lebih besar (Gambar 7-16B). Hal ini karena persentase meningkat dari preparat dengan sifat dasar yang rendah akan jauh lebih besar daripada respon dalam preparat dengan sifat dasar tingkat tinggi. Rata-rata seperti kumpulan data tersebut menghasilkan variabilitas tingkat tinggi. Secara umum, kesalahan seperti transformasi tersebut sangat heteroscedastic, dan menjadi lebih besar pada asimtot maksimal (Gambar 7-16C).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-16. Respon dihadirkan sebagai persentase dari respon dasar. A. Kesalahan standar dari rata-rata (SEM) tergantung pada konsentrasi obat (seperti untuk respon Δ). B. rata-rata 40 kurva menunjukkan variasi yang luas, dan kurva halus tidak jelas bahkan setelah 40 rata-rata kurva dosis-respons. C. Kesalahan standar tergantung pada konsentrasi dan tinggi.

Sejauh perkiraan terbaik dari respon obat yang diperoleh dalam preparat di mana efek dasar dinetralkan (dengan pengurangan respon dasar) dan variabilitas kemampuan maksimal dari sistem dieliminasi. Ini dilakukan dengan mengukur respon maksimal dari persiapan tertentu dan mengekspresikan respon daya tarik sebagai persentase maksimum (gambar 7-17A). Jelas, hal ini mungkin di hanya persiapan yang memungkinkan pengukuran lebih dari satu respon terhadap obat. Gambar 7-17 B menunjukkan cara persentase acak respon maksimal (yaitu, masing-masing satu respon secara acak diperoleh dihitung kembali sebagai sebuah persentase maksimal dalam persiapan tertentu). Seperti yang dilihat dari gambar ini, respon stabil rata-rata diperoleh setelah sedikit pengulangan. Kesalahan asumsi Boltzmann seperti pendistribusian, menjadi 0 di permulaan dan batas maksimal, karena faktanya bahwa ini diatur ke 0 dan 100 berturut-turut (gambar 7-17C). Oleh karena itu, satu-satunya variasi yang diamati adalah dalam preparasi sensitif (nilai-nilai konsentrasi efektif 50% (EC50)).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-17. respon dihitung sebagai persentase dari respon maksimal. A. Distribusi standard error dari rata-rata (SEM) adalah berbentuk lonceng, menjadi rendah di ambang dan asimtot maksimal. B. Kurva rata-rata tidak berubah secara jelas sehubungan dengan lokasi atau bentuk. C. Kesalahan standar tertinggi pada konsentrasi efektif 50% (EC50).

Perkiraan yang lebih baik dari respon biologis terhadap suatu obat dapat diperoleh dari persiapan yang memungkinkan penentuan kurva respon-dosis lengkap (gambar 7-18). Sistem berharga tersebut merupakan arus utama reseptor farmakologi dalam banyak dari mereka memungkinkan untuk mengulang kurva respon-dosis dengan sedikit perubahan dalam sensitivitas. Dalam keadaan ini, metode nol dapat digunakan untuk menggambarkan efek obat-reseptor yang jelas.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


GAMBAR 7-18. kurva dosis-respon sequintial dan kumulatif. A. Pengukuran respon terhadap obat diikuti dengan pengukuran respon maksimal dalam persiapan yang sama. Dalam keadaan ini, respon terhadap masing-masing obat diskalakan untuk persiapan biologis tertentu. B. kurva dosis-respons lengkap diperoleh dalam persiapan bilogic tunggal. Beberapa jaringan dapat berulang kali ditantang dengan obat untuk mendapatkan kurva dosis-respons penuh. Persiapan lainnya memberikan respon berkelanjutan sehingga efek kumulatif obat dapat diamati untuk menghasilkan kurva dosis-respons.

E. Respon dan Efek Sementara
Pada dasarnya tiga cara untuk mengukur respon: respon laju keadaan stabil, produk keadaan stabil, dan produk kumulatif. Dari jumlah tersebut, dua yang pertama mengacu pada situasi dimana waktu equilibrium yang cukup secara teoritis dapat dialokasikan antara obat dan reseptor (dan proses respon pembacaan terlampir) untuk mengabaikan kendala temporal. Idealnya, perilaku temporal respon dapat divisualisasikan untuk memastikan bahwa keadaan stabil telah dicapai-yaitu, respon dapat diukur secara real time. Sebaliknya, respon produk kumulatif benar-benar bergantung pada waktu dan dengan demikian membutuhkan waktu equilibrium sewenang-wenang yang berfungsi untuk meminimalkan efek sementara terhadap aktivitas obat yang diamati.

-Eksperimen Real Time
Ini jauh lebih nyaman dan akurat untuk melakukan eksperimen secara real time, dan untuk memperoleh variabel dependen pada saat mereka dihasilkan. Alternatifnya adalah, pada dasarnya, untuk mengambil snapshot dari percobaan, secara leluasa hentikan reaksinya, dan mengkaji produknya: (percobaan dilakukan dalam "stop-time"). Meskipun pendekatan yang terakhir ini jelas cacat, terdapat banyak kejadian dimana hal ini cukup penting (vide infra). Jenis percobaan ini memiliki kelemahan bahwa titik waktu yang dipilih mungkin tidak mencerminkan reaksi reseptor obat dengan akurat. Hal ini menjadi masalah yang lebih besar dengan respon yang lebih kompleks (yaitu, respon seluler fungsional), karena reaksi biokimia semua memiliki sifat kinetik dan produk tergantung pada, tidak hanya kuantitas reaktan tetapi juga laju di mana reaktan berinteraksi. Keuntungan dari percobaan secara real time dapat diilustrasikan dengan contoh sederhana.

Misalkan bahwa suatu respon biologis tertentu terdiri dari pembentukan second massenger biokimia dalam sel . Kebanyakan level second messenger (yaitu, siklik AMP, fosfat inositol, Ca2+) diatur ketat dalam sitosol. Sebagai contoh, enzim phosphodiesterase menurunkan AMP siklik, sehingga mencegah pencapaian luar biasa tinggi, dan oleh karenanya beracun. Kontrol tersebut juga memungkinkan untuk respon sementara ; yaitu , sel merespon stimulus awal tetapi, ketika ini dilepas, mereka dengan cepat kembali ke keadaan basal mereka. Oleh karena itu, banyak sistem respon memiliki semacam sistem kontrol yang menghilangkan second messenger dan juga responnya. Penyederhanaan ini sudah menunjukkan banyak kompleksitas di dalamnya bahwa terdapat, minimal, delapan parameter kontrol yang dapat bervariasi dalam sebuah sistem, seperti empat untuk produksi second messenger dan empat lainnya untuk sistem degradatory. Ini adalah: 
  1. Kapasitas maksimal dari sistem, 
  2. Kesensitifitas sistem, 
  3. Laju onset reaksi, dan 
  4. laju offset reaksi. Berbagai kombinasi dari parameter tersebut dapat secara luas menghasilkan karakteristik respon yang berbeda. Salah satu contoh diberikan di sini.

Asumsikan bahwa sel memiliki sistem dengan sensitivitas tertentu untuk menghasilkan respon positif (kurva dosis-respon sigmoidal positif, respon 2 ditunjukkan pada Gambar 7-19A) dan kemampuan 66% untuk menurunkan second messenger dengan sensitivitas 10 kali lipat lebih besar (kurva dosis-respon terbalik, respon 1 pada Gambar 7-19A yang ditunjuk). Jika laju kedua reaksi yang berlawanan ini sama, maka jelas tidak ada peningkatan jumlah second messenger yang akan terjadi. Namun, sistem dimana produksi second messenger sangat cepat dan degradasi, meskipun muncul pada konsentrasi rendah, dan terjadi sangat jauh lebih lambat, akan menghasilkan pola respon yang kompleks. Waktu berjalan untuk dua reaksi ditunjukkan angka 7-19 B; mereka dipilih dengan sengaja sehingga reaksi paling sensitif (respon I) menjadi yang paling lambat.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7-19 . Respon kompleks dengan perbedaan sensitivitas sementara. A. Persiapan menghasilkan dua respon yang berlawanan dengan agonis. Response I lebih sensitif dan menyebabkan penurunan metabolisme sel. Respons 2 sensitifitasnyna lebih rendah dan menyebabkan metabolisme sel meningkat . B. Tingkat produksi respon 2 jauh lebih tinggi daripada tingkat produksi respon I. C. Hasil dari tiga respon dengan konsentrasi agonis berbeda; pengaruh waktu ekuilibrasi dengan agonis. Sebuah concentration rendah (0,003) meningkat secara monoton, concentrations lebih tinggi (0,03) meningkat sampai maksimum dan kemudian memudar, dan dosis tertinggi (1,0) menghasilkan puncak yang tajam dan kemudian merosot tajam. D. kurva Dosis - respon terhadap agonis diambil pada empat waktu yang berbeda dari paparan agonis. Perhatikan perubahan menyeluruh pada ambang batas, kemiringan, bentuk, dan asimtot maksimal kurva (ke agonis yang sama) yang diambil pada waktu yang berbeda.

Dalam keadaan ini, waktu berjalan untuk produksi respon akan bervariasi dengan konsentrasi karena perbedaan sensitivitas dari dua respon pada subtrate. Gambar 7-19C menunjukkan jalannya waktu untuk tiga konsentrasi obat yang merangsang produksi second messenger. Kompleksitas tersebut praktis menimbulkan masalah langsung dalam puncak respon terjadi pada point waktu yang berbeda untuk konsentrasi yang berbeda. Dalam situasi ini, kurva dosis-respons yang dihasilkan untuk satu set lengkap konsentrasi obat sangat kompleks dan berubah bentuk seiring dengan waktu (lihat gbr 7-19D).

Sebuah gambaran yang lebih komprehensif dari hubungan yang saling mempengaruhi antara waktu dan konsentrasi dalam sistem tersebut dapat dilihat dalam tiga dimensi. Gambar 7-20 A menunjukkan serangkaian kurva dosis - respon terhadap agonis, diperoleh pada titik waktu yang berbeda sebagai satu permukaan. Beberapa gagasan dari kurva dosis-respons stop time dapat lihat dalam gambar 7-20 B , C , D dan E, yang mana reaksinya diperoleh pada menit ke 5, 12, 20 dan 40 yang dimulai dari menit ke 0. Point pembekuan waktu tersebut sama dengan seperti yang ditunjukkan oleh fihur 7-20D. Contoh tersebut menggambarkan kemungkinan pengaruh waktu pada potensi obat yang jelas atau sesitivitas sistem biologis. Sering efek tersebut tidak terhindarkan, dan beberapa point waktu telah dipilih untuk analisis. Namun, kemampuan untuk mengukur reaksi pada waktu tersebut membiarkan observasi pada periode paling stabil untuk analisis dan dapat mengganggu waktu penyeimbangan.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


Figure 7-20. kurva respon-dosis untuk sistem dideskribsikan pada figure 7-19 diambil pada berbagai waktu. A. evolusi perubahan bentuk pada kurva respon-dosis yang diukur pada variasi titik waktu. B-E. perluasan pandangan pada bagian penunjukan hasil kurva setelah 5 menit (B), 12 menit (C), 20 menit (D), dan 40 menit (E)

-Eksperimen Stop-Time
Alternatif bekerja pada waktu nyata (Real time) adalah dengan membiarkan reaksi berlanjut untuk satu periode waktu yang telah ditentukan, untuk menghentikannya dan untuk melihat hasilnya. Seperti yang telah didiskusikan sebelumnya, kerugian pasti dari tidak dapat melihat keadaan stabil (yaitu, hentikan reaksinya ketika tidak ada perubahan lanjutan yang terlihat) tidak dapat dihindari. Namun, terdapat beberapa contoh kejadian dimana metode ini menjadi sangat penting. Contohnya, dalam percobaan pengikatan radio ligan, jumlah radioaktif ligan yang berikatan dengan reseptor harus diukur, dan ini membutuhkan radioaktif yang telah terukur, yang akan membutuhkan waktu. Aksi pengikatan tersebut harus dihentikan pada point waktu tertentu sebelum penetapan sejauh mana reaksi yang telah hilang dapat dibuat.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Figure 7-21. perhitungan produk biokimia sebagai respon “stop-time”. Tingkat produksi produk biokimia pada dua agonist yang sama aktif pada perbedaan tingkat onset. Jumlah produk yang terbentuk dalam area di bawah kurva respektif. B. Area di bawah kurva yang diplotkan sebagai respon terhadap waktu. Garis vertikal menunjukkan dua stopping point untuk reaksi. Point waktu tercepat sedikit merendahkan respon terhadap agonis yang lebih lambat. Hal ini direfleksikan dalam jumlah rendah yang berbeda dari produk biokimia sebagai fraksi yang terbuat dari agonist yang lebih cepat. Perbedaan ini akan menjadi snagat rendah dengan menghetikan reaksi pada point waktu terlama.

Sebuah ilustrasi dari reaksi “stop-time” dari dua obat dengan perbedaan kinetic ditunjukkan pada figure 7-21A. Figur 7-21 A mengilustrasikan tingkat aktivasi respon oleh obat, agonis yang ditunjukkan oleh garis padat memiliki tingkat onset yang lebih cepat. Laju fraksi aktivasi untuk onset laju orde pertama dapat dimodelkan dengan mengikuti persamaan:

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Dimana laju kedudukan reseptor terhadap waktu (t) adalah p, dan persamaan aktivasi adalah PA. Laju onset digambarkan oleh k, dan konstanta keseimbangan disosiasi obat terhadap reseptor adalah KA.

Dua garis putus-putus vertikal pada figure 7-21A menunjukkan dua perbedaan “stop-time”; yang paling jauh ke kiri adalah keadaan sebelum dicapai keadaan stabil, mengingat garis di sebelah kanan merupakan waktu ketika aktivasi yang hampir lengkap terjadi. Dalam reaksi “stop-time” dimana produk aktivasi reseptor diukur (misalnya produksi metabolit seluler), sejumlah produk tertentu oleh area di bawah kurva diperlihatkan pada figure 7-21A. Hal ini terekspresikan sebagai integral pada persamaan 7.3:

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Area di bawah kurva diperlihatkan pada figure 7-21A sebagai fungsi waktu terhadap dua agonist yang ditunjukkan oleh figure 7-21B dengan mengiringi dua reaksi point “stop-time”. Yang patut diperhatikan tentang garis produk reaksi yakni jelas melekuk pada point waktu tercepat. Hal ini cocok dengan kekurangan produksi karena laju onset yang tidak lengkap. Produk reaksi kecil terbentuk ketika aktivasi reseptor belum mencapai keadaan stabil. Kekurangan ini lebih dilafalkan dengan obat yang memiliki onset rendah (perhatikan garis putus-putus cocok dengan agonist yang paling lambat); oleh karena itu, kesalahan terlihat pada pengukuran jumlah produk karena perbedaan dalam tingkat aktivasi. Kesalahan ini menjadi kurang penting dengan waktu penyeimbangan yang lebih lama(perhatikan persentase relatif respon kedua obat pada dua stop-time). Secara umum, periode untuk menghitung produk biokimia dalam eksperimen “stop-time” harus keliru pada sisi lebih panjang dibanding dibutuhkan untuk meminimalkan kesalahan karena perbedaan dalam laju onset obat.

BAB III
KESIMPULAN
Dari makalah di atas, dapat disimpulkan bahwa:
  1. Obat dan reseptor obat dapat dipelajari baik dengan pengikatan biokimia maupun dengan observasi sistem fungsional dalam merespon obat; terdapat masing-masing kelebihan dan kelemahan pada dua pendekatan tersebut.
  2. Secara umum, studi fungsional fokus pada populasi parsial reseptor, sedangkan studi pengikatan mempelajari populasi penuh. Dengan fungsional, selektivitas luar biasa dapat dicapai berdasarkan fakta bahwa hanya sedikit reseptor selektif yang diperlukan. 
  3. Dalam studi pengikatan, sistem harus di maksimalkan untuk mancapai pengikatan spesifik maksimum (level rendah dari pengikatan non spesifik), memiliki waktu penyeimbangan yang cukup untuk mencapai keadaan stabil, dan kemungkinan terkecil penyimpangan konsentrasi ligan dengan menikat reseptor. 
  4. Preparasi biologis umumnya memiliki jendela stabilitas dengan periode awal tidak stabil (untuk menyeimbangkan dan penyembuhan dari trauma) dan periode penurunan fungsi (karena kekurangan metode in vitro untuk menyokongnya), ini diasumsikan dalam semua eksperimen bahwa sistem sensitivitas tidak berubah. 
  5. Perubahan bentuk dari kurva Respon-dosis selama manipulas reseptor (yaitu penambahan agonist) dapat menandakan efek secondary agonist. 
  6. Terdapat sejumlah metode untuk menyatakan respon pada obat. Index-index dari fungsi kasar jaringan dapat dikaburkan dengan variasi fungsi dasar jaringan. Mengubah respon delta (respon yang tidak termasuk respon dasar) mengurangi efek dasar tapi dapat memiringkan kesalahan distribusi. 
  7. Indikator terbaik dari sensitivitas jaringan dan respon obat diperoleh ketika respon dapat diukur seiringi dengan mengukur respon maksimal yang dapat ditimbulkan pada jaringan. Respon delta dinyatakan sebagai persentase dari data delta maskimal normal untuk jaringan yang berbeda. 
  8. Eksperiman waktu nyata (real time) lebih cenderung digunakan dibanding stop-time karena kinetika produksi respon dapat dilihat. Eksperimen stop-time dapat menghasilkan kesalahan dalam perbandingan antara obat dengan tingkat onset yang berbeda. Hal ini dapat diminimalisirkan dengan memperlama waktu penyeimbangan.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
BAB I
PENDAHULUAN

A. Rumusan Masalah
Rumusan masalah yang diangkat dalam makalah ini ialah sebagai berikut :
  1. Apa yang dimaksud dengan pengukuran interaksi obat-reseptor? 
  2. Bagaimana prinsip studi pengikatan biokimia? 
  3. Bagaimana prinsip studi fungsional? 
  4. Apa yang dimaksud dengan pengukuran respon obat? 
  5. Apa yang dimaksud dengan respon dan efek sementara? 

B. Tujuan
Adapun tujuan dari penulisan makalah ini adalah sebagai berikut :
  1. Untuk mengetahui prinsip pengukuran interaksi obat-reseptor. 
  2. Untuk mengetahui tentang studi pengikatan biokimia. 
  3. Untuk mengetahui tentang studi fungsional 
  4. Untuk mengetahui prinsip pengukuran respon obat 
  5. Untuk mengetahui tentang respon dan efek sementara obat 

C. Manfaat
Manfaat yang dapat diperoleh dalam penulisan makalah ini adalah sebagai berikut:
  1. Mahasiswa dapat mengetahui prinsip pengukuran interaksi obat-reseptor. 
  2. Mahasiswa dapat mengetahui mengetahui tentang studi pengikatan biokimia. 
  3. Mahasiswa dapat mengetahui tentang studi fungsional. 
  4. Mahasiswa dapat mengetahui prinsip pengukuran respon obat. 
  5. Mahasiswa dapat mengetahui tentang respon dan efek sementara obat. 

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengukuran Interaksi Obat-Reseptor
Jelas bahwa informasi relevan tentang obat-obatan dan reseptor akan didapatkan dari monitoring interaksi antara keduanya. Umumnya, terdapat dua pendekatan percobaan besar yang digunakan untuk ini, khususnya, pengukuran pengikatan obat dengan populasi reseptor (Studi pengikatan biokimia) dan pengukuran respon seluler (atau subseluler) yang dihasilkan dari interaksi obat dengan reseptor (studi fungsional). Studi pengikatan biokimia berkonsentrasi pada kelakuan populasi total dari reseptor, sedangkan, studi fungsional dapat meninjau populasi parsial (sebagian) (gambar 7.1). Ini baik untuk mempertimbangkan keuntungan dan kerugian relatif dari kedua pendekatan tersebut.

Gambar 7-2A menunjukkan kurva dari pengikatan ligand pada tiga populasi reseptor. Populasi reseptor 1 yang paling sensitif pada ligand, tapi hanya ada sedikit reseptor dibanding dua lainnya.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar tersebut juga menunjukkan kurva pengikatan individual pada masing-masing tiga populasi reseptor sama halnya untuk kurva pengikatan total terhadap semua reseptor. Hal tersebut bisa dilihat pada gambar ini.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-2. Interaksi antara ligan dengan tiga populasi reseptor yang berbeda. A. ligand terikat pada tiga populasi dengan afinitas berbeda. Terlihat bahwa yang paling kuat adalah populasi 1, namun populasi ini mengandung lebih sedikit jumlah reseptor dibanding dua populasi lainnya. B. lingkaran menunjukkan ukuran relatif dari tiga populasi reseptor dan interaksi relatif dari berbagai konsentrasi ligan (dalam lingkaran tergelap) dengan setiap populasi. Panel menunjukkan konsentrasi ligan paling rendah, yang hampir berinteraksi ekslusif dengan populasi 1. Konsentrasi ligan meningkat (panel b-e), interaksi ligan keluar ke arah populasi reseptor lainnya. C. jumlah reseptor terikat ditunjukkan dalam kurva garis padat. Presentase pengikatan pada populasi 1 ditunjukkan dalam kurva garis putus-putus. Konsentrasi ligan meningkat, persen relatif pengikatan hanya pada populasi 1 menurun.

yang mengingatkan bahwa konsentrasi rendah ligan terutama mengikat pada reseptor populasi 1, konsentrasi yang lebih tinggi keluar ke populasi reseptor lainnya. Selain itu, pada saat ini terjadi, karena populasi reseptor lainnya (populasi 2 dan 3) lebih besar dibanding reseptor 1, semakin banyak ligan yang ditambahkan, semakin banyak pengikatan yang terjadi pada kedua populasi tersebut dibandingkan pada populasi utama. Pengikatan relatif dari konsentrasi tertentu dari ligan (ditunjukkan oleh lingkaran tergelap) pada tiga populasi reseptor ditunjukkan pada gambar 7-2B. tidak hanya konsentrasi ligan yang lebih besar yang mengikat pada populasi reseptor 2 dan 3, tapi juga pusat lingkaran tergelap berpindah, menunjukkan bahwa selektifitas ligan untuk reseptor 1 hilang pada konsentrasi yang lebih tinggi.

Gambar 7-2C menunjukkan fraksi yang berkurang dari total reseptor sehubungan dengan populasi reseptor 1 dengan peningkatan konsentrasi ligan. Umumnya, ini menggambarkan kesulitan dalam menahan spesifitas efek obat dengan studi pengikatan. Ligan harus sangat luar biasa selektif untuk mencapai total pengikatan dengan populasi reseptor tanpa berinteraksi dengan tempat lain. Dalam hal ini, studi tentang populasi parsial reseptor memiliki keuntungan. Meski demikian, studi pengikatan dapat melengkapi data tidak ternilai tentang stoikiometri interaksi obat-reseptor dan sifat jenis yang dibentuk. Selain itu, kompleks obat-reseptor dapat dipelajari secara langsung, dengan menginterpretasikan bentuk kurva pengikatan pada kondisi molekular.

B. Studi Pengikatan Biokimia
Sebagian besar informasi tentang interaksi obat-reseptor bisa diperoleh dari studi jumlah dan cara pengikatan obat berlabel radio dengan reseptor. Umumnya, konsentrasi tertentu obat berlabel radio seimbang dengan preparasi yang mengandung reseptor (yaitu sel utuh, fragmen sel membran) untuk periode waktu yang telah ditentukan (cukup bagi reseptor dan obat untuk saling berikatan dalam jumlah sama dengan satu sama lain). Selanjutnya, preparasi reseptor secara fisik diisolasi dan aktifitas radio (radio aktif) diukur. Besarnya sinyal radioaktif berbanding lurus dengan jumlah ikatan obat pada reseptor dan, karena konsentrasi obat diketahui, kurva respon-dosis dari pengikatan tersebut dapat diperoleh (Gambar 7-3). Obat yang paling radiolabel berikatan pada tempat lainnya dalam membran di samping reseptor tersebut (disebut ikatan non spesifik); oleh karena itu, eksperimen paralel dijalankan pada obat yang diketahui berikatan dengan reseptor hadir dalam sebuah konsentrasi akan melindungi populasi reseptor dari penandaan radiolabel. Jika radioaktif dari pengikatan non spesifik ini disubstratkan dari jumlah total pengikatan (reseptor ditambah tempat non spesifik), hasilnya radioaktif hanya berhubungan dengan populasi reseptor.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-3.Skema diagram dari proses pengikatan radio ligan. Eksperimen parallel dioperasikan, satu dengan radio ligan yang melibatkan inkubasi preparasi reseptor dengan radioligan dan satunya lagi radiologand dengan adanya konsentrasi penuh dari -nonaktif- reseptor ligan aktif yang akan melindungi reseptor saja dari pengikatan dengan radioligan. Dua kurva menunjukkan kembali dua hasil dari proses ini yang diulang dengan jarak konsentrasi radioligan. Pengurangan kedua kurva menghasilkan sejumlah radio ligan yang berikatan hanya dengan reseptor (pengikatan spesifik; bawah kurva)

Pengikatan radio ligan pada tempat populasi ikatan non spesifik (nsb) yang besar dari campuran asal dapat diperkirakan dengan garis hubungan antara konsentrasi radioligan dan jumlah ikatan nonspesifik:
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
Total pengikatan radioligand pada populasi reseptor terdefinisi (di mana pengikatan berupa ikatan jenuh) dan banyak populasi besar dari tempat nonreseptor lainnya (ikatan no-spesifik) dapat dimodelkan oleh suatu penjumlahan adsorpsi isoterm `Langmuir` dan model linear ikatan non-spesifik:
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS
Cara yang akurat untuk mencapai hal ini adalah mencocokkan kurva pengikatan total dan pengikatan non-spesifik (ditentukan secara terpisah) secara serempak pada persamaan 7.2 dan 7.3, berturut-turut. Dalam keadaan asimtot (garis lurus mendekati kurva) maksimal untuk pengikatan reseptor (B max) dan sensitifitas preparasi reseptor pada radioligand (Kd‘ konstanta keseimbangan disosiasi kompleks reseptor radioligan) dapat diperkirakan secara matematis dan dibandingkan dengan model reseptor.

Salah satu pertimbangan studi pengikatan adalah persyaratan bahwa proses pengikatan tidak mengubah konsentrasi bebas ligan (Lihat Bab 5). Untuk memastikan ini, pengikatan konsentrasi tertentu ligan diukur pada berbagai jumlah material reseptor (biasanya membran sel yang mengandung reseptor). Saat jumlah reseptor menjadi cukup besar untuk mengimbangi jumlah radioligand, jumlah yang terikat mencapai batas. Ini digambarkan dengan kelengkungan kurva pengikatan konsentrasi untuk meningkatkan jumlah reseptor (Fig 7-4A). Catat bahwa daerahdi mana pengikatan mengubah konsentrasi bebas radioligan, percobaan harus dilakukan di daerah linier kurva (Fig 7-4A).
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7-4. Keseimbangan kondisi untuk studi pengikatan.
  • A. efek dari peningkatan konsentrasi reseptor pada produksi kompleks antara reseptor dan radioligand. Saat konsentrasi reseptor meningkat, pengikatan mengimbangi jumlah radiologand bebas sampai terjadi saturasi (yaitu tida ada radioligand lainnya dalam medium untuk melakukan pengikatan dan tidak ada kompleks reseptor-ligan yang terbentuk). Untuk penilaian akurat dari parameter dan penggunaan model reseptor, sinyal dan konsentrasi reseptor harus dijaga tetap berada di bagian linier kurva ini (di dalam area persegi). 
  • B. kinetika keseimbangan radioligan dengan reseptor. Percobaan harus dilakukan setelah keadaan stabil telah dicapai (kesetimbangan dataran tinggi). Selain itu, pengikatan harus bersifat reversibel bahwa ketika dicuci dengan medium bebas obat, radioligand harus terbebas dari reseptor. 

Pertimbangan lain dalam studi pengikatan adalah bahwa pengikatan mengacu pada kinetika orde pertama. Dengan demikian, pengikatan harus mencapai maksimum dengan meningkatkan waktu dan reversibel pada pencucian dengan media bebas obat (Fig 7-4B). Karena eksperimen pengikatan dilakukan pada waktu “stop-tim” (vide infra), preparasi reseptor harus berimbang dengan ligan untuk jangka waktu yang cukup untuk mencapai keseimbangan (Fig 7-4B).

Jumlah total radioligand yang terikat pada preparasi yang bisa digantikan oleh ligan pelindung spesifik untuk populasi reseptor menentukan pengikatan spesifik pada preparasi (yaitu, jumlah relative pengikatan total reseptor). Untuk beberapa pengikut radioligan (atau beberapa reseptor pengikut spesifik preparasi membran), pengikatan non-spesifik mungkin sangat tinggi sehingga mendefinisikan jumlah yang relatif kecil pada sinyal reseptor (Fig 7-5A). Dalam keadaan ini, definisi jelas dari peristiwa pengikatan reseptor, sulit dan tunduk pada kesalahan Statistik. Namun, beberapa ligan sangat selektif untuk reseptor dibanding tempat non-spesifik, dan pengikatan non-spesifik sangat rendah. Dalam keadaan ini, sebagian besar sinyal bisa dihubungkan dengan reseptor (Fig 7-5B). Secara umum, kondisi eksperimental harus dioptimalkan untuk pengikatan spesifik maksimum.

Seperti telah dibahas sebelumnya, pengukuran langsung dari jumlah kompleks yang terbentuk antara obat dan reseptornya memungkinkan bentuk kurva dosis-respon diinterpretasikan pada kondisi molekular. Secara umum, Semua analisis ini membandingkan pengikatan yang diobservasi pada model adsorpsi isotherm Langmuir (Lihat Bab 3) untuk pengikatan ligan tunggal ke tempat populasi tunggal yang serupa. Penyimpangan dari model ini dapat diinterpretasikan pada keadaan multisite populasi atau multistate populasi, dimana oleh reseptor diubah ke entitas lain dalam pengikatan. Ketajaman penyimpangan dari model sederhana ini dapat sangat dibantu oleh Statistik.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


C. Studi Fungsional
-Tipe-tipe Respon Obat
Sistem kehidupan biologis biasanya memiliki indikator karakteristik pada keadaan fisiologis (misalnya, tingkat dasar metabolisme, tekanan ion hydrogen, nada tekanan otot). Respon biologis dapat diukur setelah indikator fisiologis yang sesuai telah teridentifikasi. Ada dua persyaratan dasar untuk faktor ini:
  1. Rasio signal-to-noise harus cukup untuk membedakan perubahan induksi obat, dan 
  2. Aktivitas dasar harus stabil untuk memungkinkan pengukuran perubahan. 
Besaran nyata dari respons obat, dengan asumsi bahwa sensitivitas dari alat-alat pengukur cukup untuk mendeteksi sinyal, tidak hampir sepenting hubungannya dengan keributan acak dari preparasi. Kebutuhan awal yang dihadapi adalah stabilitas dasar dari sistem reseptor.

-Stabilitas Sistem
Secara umum, pengukuran respon biologis obat memerlukan sistem reseptor yang kompleks untuk mengenal obat dan menerjemahkan informasi dan sistem transduksi untuk memperkuat stimulus dan menghasilkan sinyal yang terukur. Seringkali, proses ini kemudian melibatkan tambahan proses dasar yang berkelanjutan dalam sel. Sebagai contoh, second messenger, AMP siklik, hadir dalam sitosol sebagai hasil dari fungsi dasar adenilat silase.

Demikian pula, tujuh reseptor transmembran ada dalam populasi parsial yang secara spontan aktif dan dengan demikian menghasilkan aktivitas biologis dasar tingkat rendah. Secara umum, percobaan biologis memiliki jendela karakteristik stabilitas dan kelangsungan hidup kedua sisi yang tidak cocok untuk data terpercaya. Sering preparasi dari sistem in-vitro (misalnya, penempatan kultur sel, pembedahan jaringan terisolasi) mengalami trauma dan menghasilkan aktivitas dasar dari sistem yang tidak sesuai, tidak stabil dan bervariasi. Dengan demikian, untuk mencapai stabilitas, suatu periode seimbang harus dilakukan sebelum percobaan (Fig 7-6). Preparasi bervariasi dalam panjang waktu mereka tetap stabil, tetapi perbedaan pasti antara kondisi alami dan kondisi in vitro akan mengarah ke kemerosotan fungsi. Tingkat dari kemerosotan juga dapat tersedia, oleh karena itu data yang diambil pada periode ini tidak valid.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Prinsip percobaan independen dalam preparasi reseptor yang berbeda adalah bahwa sensitivitas dan kemampuan bereaksi dari sistem biologis tidak berubah sepanjang masa percobaan. Sering sulit untuk memperoleh data untuk mendukung asumsi ini, sehingga hal ini harus diterima tanpa kualifikasi. Ada dua pendekatan yang luas digunakan mengurangi potensi kesalahan untuk sistem ketidakstabilan. Pertama adalah "membenarkan" perubahan fungsi dasarl dalam eksperimen. Sebagai contoh, jika pada keadaan istirahat preparasi dapat disimpulkan dari respon garis dasar dalam ketiadaan obat, maka penyimpangan pada garis dasar dapat diekstrapolasi dan diasumsikan dalam perhitungan respon obat. Jika penyimpangan ini berupa garis linier, maka akan lebih mudah diprediksi dibanding jika pengamatan yang biasanya lebih sering dilakukan pada kemerosotan hyperbolic garis baseline sering diamati dari baseline (Gambar 7-7).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7.7. Pengaruh perpindahan baseline pada kurva. Baselines dapat menurun secara monoton (garis lurus, tracing atas) atau eksponensial (tracing yang lebih rendah). Jika kurva dosis-respon diperoleh dari pergerakan baseline ini, kurva yang menunjukkan A ke D akan muncul. Kurva dosis-respon bawah adalah kurva yang diperoleh secara eksperimental dibandingkan dengan kurva yang sebenarnya (yaitu, tidak ada baseline yang menghilang). Seperti dapat dilihat dari gambar ini, pemudaran awal eksponensial menghasilkan kesalahan yang paling menonjol. Seacra umum, pemudaran baseline mempengaruhi asimtot maksimal tetapi tidak pada lokasi parameter kurva respon-dosis.

Tipe kedua dari pengoreksian adalah melalui preparasi eksperimen sekunder "kontrol" dimana tidak ada perlakuan obat yang diperoleh dan hanya fungsi dasar yang dipantau. Ini mungkin lebih berbahaya dibanding pengoreksian intraeksperimental sebagai variabilitas antara dua preparasi berbeda yang disatukan. Ini bisa serius karena preparasi yang berbeda mungkin memburuk pada tingkat yang sangat berbeda. Sebagai contoh, dapat diasumsikan bahwa dalam sistem biologis yang terdiri dari kumpulan sel (kultur sel), setelah periode kelangsungan hidup, beberapa sel tua mulai mati dan tingkat keseluruhan kematian sel berupa eksponensial (p = e-k di mana k adalah konstanta laju kematian sel dan p adalah fraksi dari sel-sel hidup yang tersisa). Asumsikan perbedaan dalam ketergantungan total sistem kemampuan merespon terhadap obat pada jumlah sel yang hidup (yaitu satu kultur mungkin lebih efisien dipasangkan dibanding yang lain atau mungkin memiliki perbedaan jumlah dalam reseptor yang diekspresikan), perbedaan sangat kecil dalam k dapat menyebabkan perubahan yang berbeda dalam sensitivitas obat dalam dua preparasi independen. Efek yang diprediksi dari eksponensial kematian sel pada kurva dosis-respon ditunjukkan pada Gambar 7-8. Hubungan kompleks tertentu antara kelangsungan hidup sel dan potensi agonis, tidak mungkin bahwa satu sistem akan menjadi kontrol yang baik untuk perubahan dalam kemampuan merespon dasar antara jaringan. Seacra umum, data yang paling valid diperoleh dari sistem stabilitas yang dikenal dan semua data harus dikumpulkan dengan baik di dalam jendela stabilitas.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7.8. Pengaruh eksponensial kematian sel dalam kurva dosis-respon pada agonis A. Percent sel yang hidup dalam waktu percobaan dalam preparasi biologis. Garis putus-putus atas mengacu pada jumlah minimal sel diperlukan untuk menghasilkan respon maksimal terhadap agonis. Garis putus-putus bawah menunjukkan jumlah minimal sel yang dibutuhkan untuk meghasilkan beberapa respon terhadap agonis B. kurva dosis-respon terhadap agonis dengan peningkatan waktu. Secara umum, jaringan kehilangan sensitivitas (seperti yang ditunjukkan oleh pergeseran ke kanan dari dosis-respon kurva), diikuti dengan hilangnya respon maksimal.

Semua preparasi reseptor fungsional memiliki jendela kemampuan respon tertentu -yaitu, jarak konsentrasi obat dimana respon terutama mengarah pada aktivasi populasi reseptor tunggal dan respon dihasilkan karena hanya untuk aktivasi populasi itu. Ketika rentang konsentrasi ini telah lewat, efek sekunder dari obat akan teramati. Dalam banyak contoh, efek sekunder tersebut dapat divisualisasikan dengan perubahan nyata di slope atau asimtot maksimal pada kurva respon-dosis (gambar 7-9). Dalam kasus lain, perubahan dalam bentuk kurva mungkin menunjukkan efek sekunder: gambar 7-10A menunjukkan serangkaian kurva respon-dosis terhadap agonis yang mengaktifkan mekanisme secondary respon pada konsentrasi melebihi 20 unit. Dalam hal ini, intervensi selektif untuk reseptor yang menarik perhatian yang mengerakkan kurva respon-dosis ke konsentrasi yang lebih tinggi tersebut (seperti reseptor antagonisme atau hilangnya sensitivitas biologis sistem untuk reseptor stimulasi) mendorong kurva terhadap dinding luar yang mana kurva menunjukkan kemiringan meningkat dan hilangnya bentuk sigmoidal yang menunjukkan aktivasi reseptor tunggal (gambar 7–10B).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


-Pengujian Fungsional Obat-Reseptor
Farmakologi penuh dengan wawasan penggunaan jaringan terisolasi untuk mengukur efek obat. Untuk sebagian besar, penggunaan sistem ini telah berguna dimana ini adalah satu-satunya pengujian yang tersedia di tahun-tahun awal untuk menaksirkan respons biologis. Namun, ketika teknologi telah memungkinkan, aliran respon stimulus telah dipotong sampai, saat ini, ada banyak poin sepanjang banyak aliran tersebut yang dapat digunakan sebagai ukuran efek obat.

Namun, prinsip dasar amplifikasi biologis -komplikasi dengan tanggapan untuk merespon diri sendiri –sekalipun pembatalan- member kesan bahwa sistem selular dengan respon pembacaan respon organ terakhir dapat menjadi sangat berharga. Sebagai contoh, meskipun jenis sel yang berbeda menghasilkan respon yang berbeda terhadap obat, tergantung pada penampilan dan lokasi mereka, semua sel mengatur respirasi sebagai fungsi biologis dasar. Salah satu hasil dari pengaturan ini adalah tekanan ion hidrogen. Dengan demikian, sebagai metabolisme dari perubahan sel, demikian juga laju di mana sel menekan ion hidrogen dalam upaya untuk menjaga keseimbangan pH (Gambar 7-11); Hal ini dapat diukur sebagai respon. Keuntungan dari sistem ini adalah bahwa hal ini umum untuk semua sel, dan karena itu, setiap kultur sel secara teoritis dapat menghasilkan respons biologis di bawah kondisi tersebut (2).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Terdapat pengujian fungsional lain yang bergantung pada sel-sel khusus untuk menunjukkan perubahan pada tingkat second messenger. Salah satunya adalah katak melanophore. Sel-sel ini meniadakan pigmentasi dengan meningkatan kadar AMP siklik dan memusatkan pigmen dalam respon terhadap berbagai agoni. Oleh karena itu, perubahan pada pigmentasi, yang dapat dilihat langsung oleh transmisi cahaya, dapat digunakan untuk memantau perubahan pada mediator tingkat sitosol yang, pada gilirannya, dapat dikendalikan oleh reseptor. Oleh karena itu, obat yang mengubah kadar AMP siklik atau second messenger lain menghasilkan perubahan pada pigmentasi, respon fungsional dapat diukur dan digunakan untuk mengukur efek obat. Metodologi ini dapat dibuat menjadi lebih kuat dengan menggunakan sel-sel ini sebagai host untuk memperlihatkan reseptor manusia secara genetik. Pada keadaan seperti itu, reseptor dapat diperkenalkan ke dalam respon penandaan sel (lihat bab 2), dan uji fungsional untuk reseptor tersebut yang dapat dibuat.

Masih tipe lain dari uji fungsional dapat dibuat dengan memperkenalkan substansi "reporter" ke dalam sel. Ini mengubah keadaan mereka dengan mengubah tingkat dari sitosol mesengger. Sebagai contoh, protein fluorescent, yang menghasilkan pendar dengan peningkatan kadar AMP siklik, dapat diperkenalkan ke dalam sel. Ketika obat mengaktifkan reseptor untuk meningkatkan AMP siklik, sel-sel fluoresensi, sebuah respon yang dapat diukur secara fotometrik. Variasi lainnya dalam pendekatan ini mengenalkan protein sensitif kalsium, seperti aequorin, yang menghasilkan cahaya pada elevasi sitosol Ca2+.

D. Pengukuran Respon Obat
Secara umum, respon obat diukur sebagai perubahan keadaan (ini dapat menjadi suatu nilai atau produk) dari keadaan dasar ke beberapa keadaan tetap (atau keadaan pada titik waktu yang berubah-ubah) yang diperoleh dengan adanya obat. Pada dasarnya ada dua titik acuan yang dibutuhkan untuk menilai status dari respon obat: keadaan dasar dengan tidak adanya obat dan respon maksimal sistem ini mampu menghasilkan respon untuk stimulus yang sama. Keadaan dasar selalu diamati, tapi respon maksimal dapat menimbulkan masalah. Ada beberapa transformasi yang digunakan untuk variabel terikat-obat (seperti respon); ini ditunjukkan pada Gambar 7-12A. Jelas, yang pertama adalah respon kasar. Penggunaan parameter ini berbahaya karena tidak mengimbangi besarnya salah satu titik referensi (yaitu, keadaan dasar atau respon maksimum). Oleh karena itu, variasi dalam besarnya ini tercermin sebagai variasi dalam respon obat, dengan bersamaan hilangnya akurasi. Teknik lain yang paling umum adalah dengan menggunakan perbedaan dalam keadaan sistem pada ketiadaan dan kehadiran obat (Δ Respon pada Gambar 7-12B). Hal Ini memiliki keuntungan dalam membatalkan perbedaan pada efek dasar.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Setelah indikator respon dipilih, terdapat sejumlah metode untuk menyatakan kuantifikasi. Jelasnya, yang paling mudah akan digunakan sebagai pembacaan respon yang benar. Masalah utama dengan pendekatan ini adalah variasi dalam aktivitas dasar pada lebih dari satu preparasi yang ditambahkan ke dalam besarnya respon obat, dengan demikian menambah kesalahan. Efek dalam variasi respon dapat diminimalkan dengan replikasi. Gambar 7-13 menunjukkan aktivitas biologis dari sistem hipotetis. Aktivitas dasar, kepekaan terhadap obat-obatan, dan kemampuan respon maksimum obat diperlakukan menjadi suara acak oleh komputer untuk 40 preparat yang berbeda (tujuh konsentrasi obat, menghasilkan 280 respon acak). Respon yang dihasilkan secara acak bercampur lebih lanjut seperti tidak ada korelasi antara respon dengan dosis berturut-turut. Dalam keadaan ini, skenario di mana hanya satu respon terhadap satu konsentrasi dapat diukur untuk preparat tertentu yang telah diproduksi dengan demikian membolehkan pembuatan kurva respon dosis dari sejumlah preparat acak.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


Seperti yang diharapkan, jika hanya satu kurva dosis-respon yang tepasang seperti demikian, terdapat derajat tinggi dari variabilitas dan representasi yang buruk dari respon rata-rata (Gambar 7-14A). Jika proses ini diulang, bagaimanapun, dan kurva dosis-respon yang dihasilkan rata-rata, representasi yang lebih akurat dari kurva sebenarnya telah diperoleh. Gambar 7-14B menunjukkan rata-rata dari kurva berturut-turut diperoleh dengan cara ini. Hal ini dapat dilihat pada tingkat variabilitas, layaknya kurva akurat diperoleh dengan rata-rata 15 sampai 20 replikasi. Standar kesalahan dari rata-rata respon mendistribusikan sepanjang konsentrasi dalam mode homogen, disebut sebagai kesalahan homeoscedastic (Gambar 7-14C).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


Gambar 7-14. Respon langsung diplot sebagai fungsi konsentrasi log. A. Tujuh respon acak dari kolam yang dipilih dan diplot sebagai kurva respon dosis-tunggal (tujuh respon datang dari preparat biologis yang berbeda). Ini mensimulasikan kondisi di mana hanya pada respon per preparat yang dapat diperoleh. Kurva dosis-respon tentu harus dibuat dengan data dari jaringan yang berbeda. Standard kesalahan untuk rata-rata atau Standard Error for Mean (SEM) kurva dibuat dengan cara ini tidak tergantung pada dosis obat. B. Empat puluh seperti kurva dosis-respons yang dipilih oleh komputer dan berurutan rata-rata (yaitu, lima puluh kurva menunjukkan lima kurva, kesepuluh kurva adalah rata-rata dari sepuluh kurva, dan sebagainya). Oleh waktu 20 kurva merupakan hasil relatif rata-rata kurva halus. C. Standar kesalahan menurun dengan rata-rata jumlah kurva.

Seperti telah dibahas sebelumnya, pengurangan dalam kesalahan dari pengukuran respon dapat dicapai dengan menghilangkan varians dalam respon dasar dengan mengurangi respon dasar dari respon induksi obat. Ini hanya meningkat aktivitas biologis untuk obat (Gambar 7-15A). Gambar 7-15B menunjukkan hasil pengubahan pada data yang dihasilkan secara acak dari Figur 7-14B. Jelas, karena respon dasar secara artifisial berkurang ke nol, variasi dalam kurva minimal pada permulaan dan meningkat dengan dosis obat. Ini menunjukkan heterogenitas dalam kesalahan, peningkatan sebagai besarnya respon meningkat (kesalahan heteroscedastic; Gambar 7-15C). Transformasi tidak mengurangi kesalahan dengan beberapa replikasi.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-15. Respon delta yang dihitung dari dataset ditunjukkan pada Gambar 7-14. A. perbedaan antara respon dasar dan respon obat masa stabil diplot sebagai fungsi dari konsentrasi log. Kesalahan berkisar dari nol di ambang dari kurva dosis-respons untuk nilai maksimal pada maksimal asimtot. B. Empat puluh simulasi kurva (seperti untuk Fig 7-14B). C Standar Error of the Means (SEM) untuk kurva rata-rata. Perhatikan ketergantungan kesalahan pada konsentrasi dan nilai kesalahan yang tinggi tidak terkendali pada asimtot maksimal ketika beberapa kurva dosis-respon dirata-ratakan

Sebuah metode alternatif untuk mengurangi dampak dari variasi awal adalah menunjukkan respon sebagai persentase dari tingkat dasar. Gambar 7-16A menunjukkan efek dari perubahan pada data yang dihasilkan secara acak. Pada umumnya, kecenderungan dengan pendekatan ini mirip dengan yang diperoleh dengan pengurangan respon dasar (Gambar 7-15A), tetapi variasi bisa jauh lebih besar (Gambar 7-16B). Hal ini karena persentase meningkat dari preparat dengan sifat dasar yang rendah akan jauh lebih besar daripada respon dalam preparat dengan sifat dasar tingkat tinggi. Rata-rata seperti kumpulan data tersebut menghasilkan variabilitas tingkat tinggi. Secara umum, kesalahan seperti transformasi tersebut sangat heteroscedastic, dan menjadi lebih besar pada asimtot maksimal (Gambar 7-16C).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-16. Respon dihadirkan sebagai persentase dari respon dasar. A. Kesalahan standar dari rata-rata (SEM) tergantung pada konsentrasi obat (seperti untuk respon Δ). B. rata-rata 40 kurva menunjukkan variasi yang luas, dan kurva halus tidak jelas bahkan setelah 40 rata-rata kurva dosis-respons. C. Kesalahan standar tergantung pada konsentrasi dan tinggi.

Sejauh perkiraan terbaik dari respon obat yang diperoleh dalam preparat di mana efek dasar dinetralkan (dengan pengurangan respon dasar) dan variabilitas kemampuan maksimal dari sistem dieliminasi. Ini dilakukan dengan mengukur respon maksimal dari persiapan tertentu dan mengekspresikan respon daya tarik sebagai persentase maksimum (gambar 7-17A). Jelas, hal ini mungkin di hanya persiapan yang memungkinkan pengukuran lebih dari satu respon terhadap obat. Gambar 7-17 B menunjukkan cara persentase acak respon maksimal (yaitu, masing-masing satu respon secara acak diperoleh dihitung kembali sebagai sebuah persentase maksimal dalam persiapan tertentu). Seperti yang dilihat dari gambar ini, respon stabil rata-rata diperoleh setelah sedikit pengulangan. Kesalahan asumsi Boltzmann seperti pendistribusian, menjadi 0 di permulaan dan batas maksimal, karena faktanya bahwa ini diatur ke 0 dan 100 berturut-turut (gambar 7-17C). Oleh karena itu, satu-satunya variasi yang diamati adalah dalam preparasi sensitif (nilai-nilai konsentrasi efektif 50% (EC50)).

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Gambar 7-17. respon dihitung sebagai persentase dari respon maksimal. A. Distribusi standard error dari rata-rata (SEM) adalah berbentuk lonceng, menjadi rendah di ambang dan asimtot maksimal. B. Kurva rata-rata tidak berubah secara jelas sehubungan dengan lokasi atau bentuk. C. Kesalahan standar tertinggi pada konsentrasi efektif 50% (EC50).

Perkiraan yang lebih baik dari respon biologis terhadap suatu obat dapat diperoleh dari persiapan yang memungkinkan penentuan kurva respon-dosis lengkap (gambar 7-18). Sistem berharga tersebut merupakan arus utama reseptor farmakologi dalam banyak dari mereka memungkinkan untuk mengulang kurva respon-dosis dengan sedikit perubahan dalam sensitivitas. Dalam keadaan ini, metode nol dapat digunakan untuk menggambarkan efek obat-reseptor yang jelas.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


GAMBAR 7-18. kurva dosis-respon sequintial dan kumulatif. A. Pengukuran respon terhadap obat diikuti dengan pengukuran respon maksimal dalam persiapan yang sama. Dalam keadaan ini, respon terhadap masing-masing obat diskalakan untuk persiapan biologis tertentu. B. kurva dosis-respons lengkap diperoleh dalam persiapan bilogic tunggal. Beberapa jaringan dapat berulang kali ditantang dengan obat untuk mendapatkan kurva dosis-respons penuh. Persiapan lainnya memberikan respon berkelanjutan sehingga efek kumulatif obat dapat diamati untuk menghasilkan kurva dosis-respons.

E. Respon dan Efek Sementara
Pada dasarnya tiga cara untuk mengukur respon: respon laju keadaan stabil, produk keadaan stabil, dan produk kumulatif. Dari jumlah tersebut, dua yang pertama mengacu pada situasi dimana waktu equilibrium yang cukup secara teoritis dapat dialokasikan antara obat dan reseptor (dan proses respon pembacaan terlampir) untuk mengabaikan kendala temporal. Idealnya, perilaku temporal respon dapat divisualisasikan untuk memastikan bahwa keadaan stabil telah dicapai-yaitu, respon dapat diukur secara real time. Sebaliknya, respon produk kumulatif benar-benar bergantung pada waktu dan dengan demikian membutuhkan waktu equilibrium sewenang-wenang yang berfungsi untuk meminimalkan efek sementara terhadap aktivitas obat yang diamati.

-Eksperimen Real Time
Ini jauh lebih nyaman dan akurat untuk melakukan eksperimen secara real time, dan untuk memperoleh variabel dependen pada saat mereka dihasilkan. Alternatifnya adalah, pada dasarnya, untuk mengambil snapshot dari percobaan, secara leluasa hentikan reaksinya, dan mengkaji produknya: (percobaan dilakukan dalam "stop-time"). Meskipun pendekatan yang terakhir ini jelas cacat, terdapat banyak kejadian dimana hal ini cukup penting (vide infra). Jenis percobaan ini memiliki kelemahan bahwa titik waktu yang dipilih mungkin tidak mencerminkan reaksi reseptor obat dengan akurat. Hal ini menjadi masalah yang lebih besar dengan respon yang lebih kompleks (yaitu, respon seluler fungsional), karena reaksi biokimia semua memiliki sifat kinetik dan produk tergantung pada, tidak hanya kuantitas reaktan tetapi juga laju di mana reaktan berinteraksi. Keuntungan dari percobaan secara real time dapat diilustrasikan dengan contoh sederhana.

Misalkan bahwa suatu respon biologis tertentu terdiri dari pembentukan second massenger biokimia dalam sel . Kebanyakan level second messenger (yaitu, siklik AMP, fosfat inositol, Ca2+) diatur ketat dalam sitosol. Sebagai contoh, enzim phosphodiesterase menurunkan AMP siklik, sehingga mencegah pencapaian luar biasa tinggi, dan oleh karenanya beracun. Kontrol tersebut juga memungkinkan untuk respon sementara ; yaitu , sel merespon stimulus awal tetapi, ketika ini dilepas, mereka dengan cepat kembali ke keadaan basal mereka. Oleh karena itu, banyak sistem respon memiliki semacam sistem kontrol yang menghilangkan second messenger dan juga responnya. Penyederhanaan ini sudah menunjukkan banyak kompleksitas di dalamnya bahwa terdapat, minimal, delapan parameter kontrol yang dapat bervariasi dalam sebuah sistem, seperti empat untuk produksi second messenger dan empat lainnya untuk sistem degradatory. Ini adalah: 
  1. Kapasitas maksimal dari sistem, 
  2. Kesensitifitas sistem, 
  3. Laju onset reaksi, dan 
  4. laju offset reaksi. Berbagai kombinasi dari parameter tersebut dapat secara luas menghasilkan karakteristik respon yang berbeda. Salah satu contoh diberikan di sini.

Asumsikan bahwa sel memiliki sistem dengan sensitivitas tertentu untuk menghasilkan respon positif (kurva dosis-respon sigmoidal positif, respon 2 ditunjukkan pada Gambar 7-19A) dan kemampuan 66% untuk menurunkan second messenger dengan sensitivitas 10 kali lipat lebih besar (kurva dosis-respon terbalik, respon 1 pada Gambar 7-19A yang ditunjuk). Jika laju kedua reaksi yang berlawanan ini sama, maka jelas tidak ada peningkatan jumlah second messenger yang akan terjadi. Namun, sistem dimana produksi second messenger sangat cepat dan degradasi, meskipun muncul pada konsentrasi rendah, dan terjadi sangat jauh lebih lambat, akan menghasilkan pola respon yang kompleks. Waktu berjalan untuk dua reaksi ditunjukkan angka 7-19 B; mereka dipilih dengan sengaja sehingga reaksi paling sensitif (respon I) menjadi yang paling lambat.

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

GAMBAR 7-19 . Respon kompleks dengan perbedaan sensitivitas sementara. A. Persiapan menghasilkan dua respon yang berlawanan dengan agonis. Response I lebih sensitif dan menyebabkan penurunan metabolisme sel. Respons 2 sensitifitasnyna lebih rendah dan menyebabkan metabolisme sel meningkat . B. Tingkat produksi respon 2 jauh lebih tinggi daripada tingkat produksi respon I. C. Hasil dari tiga respon dengan konsentrasi agonis berbeda; pengaruh waktu ekuilibrasi dengan agonis. Sebuah concentration rendah (0,003) meningkat secara monoton, concentrations lebih tinggi (0,03) meningkat sampai maksimum dan kemudian memudar, dan dosis tertinggi (1,0) menghasilkan puncak yang tajam dan kemudian merosot tajam. D. kurva Dosis - respon terhadap agonis diambil pada empat waktu yang berbeda dari paparan agonis. Perhatikan perubahan menyeluruh pada ambang batas, kemiringan, bentuk, dan asimtot maksimal kurva (ke agonis yang sama) yang diambil pada waktu yang berbeda.

Dalam keadaan ini, waktu berjalan untuk produksi respon akan bervariasi dengan konsentrasi karena perbedaan sensitivitas dari dua respon pada subtrate. Gambar 7-19C menunjukkan jalannya waktu untuk tiga konsentrasi obat yang merangsang produksi second messenger. Kompleksitas tersebut praktis menimbulkan masalah langsung dalam puncak respon terjadi pada point waktu yang berbeda untuk konsentrasi yang berbeda. Dalam situasi ini, kurva dosis-respons yang dihasilkan untuk satu set lengkap konsentrasi obat sangat kompleks dan berubah bentuk seiring dengan waktu (lihat gbr 7-19D).

Sebuah gambaran yang lebih komprehensif dari hubungan yang saling mempengaruhi antara waktu dan konsentrasi dalam sistem tersebut dapat dilihat dalam tiga dimensi. Gambar 7-20 A menunjukkan serangkaian kurva dosis - respon terhadap agonis, diperoleh pada titik waktu yang berbeda sebagai satu permukaan. Beberapa gagasan dari kurva dosis-respons stop time dapat lihat dalam gambar 7-20 B , C , D dan E, yang mana reaksinya diperoleh pada menit ke 5, 12, 20 dan 40 yang dimulai dari menit ke 0. Point pembekuan waktu tersebut sama dengan seperti yang ditunjukkan oleh fihur 7-20D. Contoh tersebut menggambarkan kemungkinan pengaruh waktu pada potensi obat yang jelas atau sesitivitas sistem biologis. Sering efek tersebut tidak terhindarkan, dan beberapa point waktu telah dipilih untuk analisis. Namun, kemampuan untuk mengukur reaksi pada waktu tersebut membiarkan observasi pada periode paling stabil untuk analisis dan dapat mengganggu waktu penyeimbangan.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS


Figure 7-20. kurva respon-dosis untuk sistem dideskribsikan pada figure 7-19 diambil pada berbagai waktu. A. evolusi perubahan bentuk pada kurva respon-dosis yang diukur pada variasi titik waktu. B-E. perluasan pandangan pada bagian penunjukan hasil kurva setelah 5 menit (B), 12 menit (C), 20 menit (D), dan 40 menit (E)

-Eksperimen Stop-Time
Alternatif bekerja pada waktu nyata (Real time) adalah dengan membiarkan reaksi berlanjut untuk satu periode waktu yang telah ditentukan, untuk menghentikannya dan untuk melihat hasilnya. Seperti yang telah didiskusikan sebelumnya, kerugian pasti dari tidak dapat melihat keadaan stabil (yaitu, hentikan reaksinya ketika tidak ada perubahan lanjutan yang terlihat) tidak dapat dihindari. Namun, terdapat beberapa contoh kejadian dimana metode ini menjadi sangat penting. Contohnya, dalam percobaan pengikatan radio ligan, jumlah radioaktif ligan yang berikatan dengan reseptor harus diukur, dan ini membutuhkan radioaktif yang telah terukur, yang akan membutuhkan waktu. Aksi pengikatan tersebut harus dihentikan pada point waktu tertentu sebelum penetapan sejauh mana reaksi yang telah hilang dapat dibuat.
MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Figure 7-21. perhitungan produk biokimia sebagai respon “stop-time”. Tingkat produksi produk biokimia pada dua agonist yang sama aktif pada perbedaan tingkat onset. Jumlah produk yang terbentuk dalam area di bawah kurva respektif. B. Area di bawah kurva yang diplotkan sebagai respon terhadap waktu. Garis vertikal menunjukkan dua stopping point untuk reaksi. Point waktu tercepat sedikit merendahkan respon terhadap agonis yang lebih lambat. Hal ini direfleksikan dalam jumlah rendah yang berbeda dari produk biokimia sebagai fraksi yang terbuat dari agonist yang lebih cepat. Perbedaan ini akan menjadi snagat rendah dengan menghetikan reaksi pada point waktu terlama.

Sebuah ilustrasi dari reaksi “stop-time” dari dua obat dengan perbedaan kinetic ditunjukkan pada figure 7-21A. Figur 7-21 A mengilustrasikan tingkat aktivasi respon oleh obat, agonis yang ditunjukkan oleh garis padat memiliki tingkat onset yang lebih cepat. Laju fraksi aktivasi untuk onset laju orde pertama dapat dimodelkan dengan mengikuti persamaan:

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Dimana laju kedudukan reseptor terhadap waktu (t) adalah p, dan persamaan aktivasi adalah PA. Laju onset digambarkan oleh k, dan konstanta keseimbangan disosiasi obat terhadap reseptor adalah KA.

Dua garis putus-putus vertikal pada figure 7-21A menunjukkan dua perbedaan “stop-time”; yang paling jauh ke kiri adalah keadaan sebelum dicapai keadaan stabil, mengingat garis di sebelah kanan merupakan waktu ketika aktivasi yang hampir lengkap terjadi. Dalam reaksi “stop-time” dimana produk aktivasi reseptor diukur (misalnya produksi metabolit seluler), sejumlah produk tertentu oleh area di bawah kurva diperlihatkan pada figure 7-21A. Hal ini terekspresikan sebagai integral pada persamaan 7.3:

MAKALAH SISTEM PENGUKURAN RESPON OBAT: KEKUATAN SIGNAL, STABILITAS DAN SELEKTIVITAS

Area di bawah kurva diperlihatkan pada figure 7-21A sebagai fungsi waktu terhadap dua agonist yang ditunjukkan oleh figure 7-21B dengan mengiringi dua reaksi point “stop-time”. Yang patut diperhatikan tentang garis produk reaksi yakni jelas melekuk pada point waktu tercepat. Hal ini cocok dengan kekurangan produksi karena laju onset yang tidak lengkap. Produk reaksi kecil terbentuk ketika aktivasi reseptor belum mencapai keadaan stabil. Kekurangan ini lebih dilafalkan dengan obat yang memiliki onset rendah (perhatikan garis putus-putus cocok dengan agonist yang paling lambat); oleh karena itu, kesalahan terlihat pada pengukuran jumlah produk karena perbedaan dalam tingkat aktivasi. Kesalahan ini menjadi kurang penting dengan waktu penyeimbangan yang lebih lama(perhatikan persentase relatif respon kedua obat pada dua stop-time). Secara umum, periode untuk menghitung produk biokimia dalam eksperimen “stop-time” harus keliru pada sisi lebih panjang dibanding dibutuhkan untuk meminimalkan kesalahan karena perbedaan dalam laju onset obat.

BAB III
KESIMPULAN
Dari makalah di atas, dapat disimpulkan bahwa:
  1. Obat dan reseptor obat dapat dipelajari baik dengan pengikatan biokimia maupun dengan observasi sistem fungsional dalam merespon obat; terdapat masing-masing kelebihan dan kelemahan pada dua pendekatan tersebut.
  2. Secara umum, studi fungsional fokus pada populasi parsial reseptor, sedangkan studi pengikatan mempelajari populasi penuh. Dengan fungsional, selektivitas luar biasa dapat dicapai berdasarkan fakta bahwa hanya sedikit reseptor selektif yang diperlukan. 
  3. Dalam studi pengikatan, sistem harus di maksimalkan untuk mancapai pengikatan spesifik maksimum (level rendah dari pengikatan non spesifik), memiliki waktu penyeimbangan yang cukup untuk mencapai keadaan stabil, dan kemungkinan terkecil penyimpangan konsentrasi ligan dengan menikat reseptor. 
  4. Preparasi biologis umumnya memiliki jendela stabilitas dengan periode awal tidak stabil (untuk menyeimbangkan dan penyembuhan dari trauma) dan periode penurunan fungsi (karena kekurangan metode in vitro untuk menyokongnya), ini diasumsikan dalam semua eksperimen bahwa sistem sensitivitas tidak berubah. 
  5. Perubahan bentuk dari kurva Respon-dosis selama manipulas reseptor (yaitu penambahan agonist) dapat menandakan efek secondary agonist. 
  6. Terdapat sejumlah metode untuk menyatakan respon pada obat. Index-index dari fungsi kasar jaringan dapat dikaburkan dengan variasi fungsi dasar jaringan. Mengubah respon delta (respon yang tidak termasuk respon dasar) mengurangi efek dasar tapi dapat memiringkan kesalahan distribusi. 
  7. Indikator terbaik dari sensitivitas jaringan dan respon obat diperoleh ketika respon dapat diukur seiringi dengan mengukur respon maksimal yang dapat ditimbulkan pada jaringan. Respon delta dinyatakan sebagai persentase dari data delta maskimal normal untuk jaringan yang berbeda. 
  8. Eksperiman waktu nyata (real time) lebih cenderung digunakan dibanding stop-time karena kinetika produksi respon dapat dilihat. Eksperimen stop-time dapat menghasilkan kesalahan dalam perbandingan antara obat dengan tingkat onset yang berbeda. Hal ini dapat diminimalisirkan dengan memperlama waktu penyeimbangan.