MAKALAH HPLC (HIGH PERAFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY) - ElrinAlria
MAKALAH HPLC (HIGH PERAFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

MAKALAH HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi tersisihkan untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih. Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini

B. Rumusan Masalah
  • a. Sejarah singkat kromatografi
  • b. Pengertian kromatografi
  • c. Mengetahui pengertian HPLC
  • d. Mengetahui prinsip HPLC
  • e. Mengetahui komponen-komponen HPLC
  • f. Mengetahui kelebihan HPLC
  • g. Mengetahui Pengaplikasian HPLC

C. Tujuan
  • a. Untuk mengetahui Sejarah singkat kromatografi
  • b. Untuk mengetahui Pengertian kromatografi
  • c. Untuk mengetahui pengertian HPLC
  • d. Untuk mengetahui prinsip HPLC
  • e. Untuk mengetahui komponen-komponen HPLC
  • f. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan HPLC
  • g. Untuk mengetahui pengaplikasian HPLC

BAB II
PEMBAHASAN
1. Sejarah Singkat Kromatografi
Tswett adalah penemu kromatografi pada tahun 1903. Perkembangan kromatografi antara lain:
  • a.kromatografi cair-padat (KCP).
  • b.Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai berkembang.Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov.
  • c. Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Karya Martin dan Synge yang pada tahun 1041 membuahkan hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas.
  • d.Pada tahun 1952, Martindan James mempublikasikan makalah pertamanya m ngenaim kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.
  • e.Hal ini menjadi dasar ditemukannya kromatografi yang canggih yaitu kromatografi cair kinerja tinggi (High Perfomance Liquid Chromatografi).

2. Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.

Kromatografi dibedakan menjadi 2 jenis yaitu:
a. Kromatografi cair (Liquid Chromatography) merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography.
  • High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
  • Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. 
  • Size exclusion chromatography atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.

b. Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.

3. Pengertian HPLC
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik analisis kromatografi cair yang digunakan baik dalam analisis kualitatif yaitu dalam bentuk pemisahan senyawa maupun dalam analisis kuantitatif yaitu penentuan jumlah senyawa didalam suatu larutan (Karlida, 2013).

Metoda High Performance Liquid Chromatography (HPLC), merupakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi yang berasal dari kromatografi kolom klasik, di mana teknik kromatografi ini bertambah maju setelah HPLC dikemas dengan bead yang sangat kecil (~ 10 mm) dan beroperasi pada tekanan tinggi (Weiss, 1995). HPLC merupakan suatu metode yang sensitif dan akurat untuk penentuan kuantitatif serta baik untuk pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap seperti asam amino, protein, pestisida dan lain-lain.

Pada saat ini, HPLC merupakan metoda kromatografi cair yang pemakaiannya telah sangat berkembang, baik untuk analisis rutin maupun untuk preparatif pada banyak laboratorium. Dibandingkan dengan kromatografi gas, HPLC dioperasikan pada suhu kamar, di mana senyawa yang tidak tahan panas dapat ditentukan dengan mudah dan sifat fasa gerak dapat diubah dengan merubah komposisi dari fasa gerak yang digunakan (Nurhamida, 2005).

4. Jenis-Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

a. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.

b. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

c. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

c. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 

d. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

e. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2. Prinsip HPLC
Adapun prinsip dari HPLC yaitu suatu sampel berupa larutan diinjeksikan kedalam kolom yang berisi fase diam dan fase gerak, kemudian diberikan tekanan tinggi sehingga fase gerak dapat mengelusi sampel keluar dari kolom dan terdeteksi oleh detektor yang kemudian dihasilkan kromatogram (Karlida, 2013).

3. Komponen-Komponen HPLC
Komponen-komponen penting dari HPLC dapat dilihat pada Gambar Blok berikut ini :

1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut
Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung.

2. Pompa
Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom fase diam dan melewati detektor. Tekanan yang digunakan beragam tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, serta laju alir dan komposisi dari fase gerak yang akan dipakai.

3. Injektor
Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem injeksi otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam kisaran volume 0.1-100 mL

4. Sampel
Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening dan tidak ada endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis, misalnya dengan melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti mengatur konsentrasi sampel, desalting, dan lain-lain.

5. Kolom HPLC
Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fase diam. Di dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor. Waktu retensi dihitung dari saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum pada detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya dapat dihitung.

6. Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak (peak) yang dihasilkan. Konsentrasi komponen yang hendak dianalisis dapat dihitung dengan membandingkan luas area peak komponen dengan luas area peak serta konsentrasi standar.

J. Keuntungan dan Kerugian HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.

a. kelebihan dari alat HPLC antara lain:
  • Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. -Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
  • Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
  • Kolom dapat digunakan kembali.
  • Waktu analisa cukup singkat.
  • HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
  • Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
  • Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

K. Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
  • Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
  • Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
  • Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

MAKALAH HPLC (HIGH PERAFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

MAKALAH HPLC (HIGH PERAFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

MAKALAH HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi tersisihkan untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih. Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini

B. Rumusan Masalah
  • a. Sejarah singkat kromatografi
  • b. Pengertian kromatografi
  • c. Mengetahui pengertian HPLC
  • d. Mengetahui prinsip HPLC
  • e. Mengetahui komponen-komponen HPLC
  • f. Mengetahui kelebihan HPLC
  • g. Mengetahui Pengaplikasian HPLC

C. Tujuan
  • a. Untuk mengetahui Sejarah singkat kromatografi
  • b. Untuk mengetahui Pengertian kromatografi
  • c. Untuk mengetahui pengertian HPLC
  • d. Untuk mengetahui prinsip HPLC
  • e. Untuk mengetahui komponen-komponen HPLC
  • f. Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan HPLC
  • g. Untuk mengetahui pengaplikasian HPLC

BAB II
PEMBAHASAN
1. Sejarah Singkat Kromatografi
Tswett adalah penemu kromatografi pada tahun 1903. Perkembangan kromatografi antara lain:
  • a.kromatografi cair-padat (KCP).
  • b.Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai berkembang.Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov.
  • c. Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Karya Martin dan Synge yang pada tahun 1041 membuahkan hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas.
  • d.Pada tahun 1952, Martindan James mempublikasikan makalah pertamanya m ngenaim kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.
  • e.Hal ini menjadi dasar ditemukannya kromatografi yang canggih yaitu kromatografi cair kinerja tinggi (High Perfomance Liquid Chromatografi).

2. Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.

Kromatografi dibedakan menjadi 2 jenis yaitu:
a. Kromatografi cair (Liquid Chromatography) merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography.
  • High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
  • Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. 
  • Size exclusion chromatography atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.

b. Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.

3. Pengertian HPLC
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik analisis kromatografi cair yang digunakan baik dalam analisis kualitatif yaitu dalam bentuk pemisahan senyawa maupun dalam analisis kuantitatif yaitu penentuan jumlah senyawa didalam suatu larutan (Karlida, 2013).

Metoda High Performance Liquid Chromatography (HPLC), merupakan teknik kromatografi cair kinerja tinggi yang berasal dari kromatografi kolom klasik, di mana teknik kromatografi ini bertambah maju setelah HPLC dikemas dengan bead yang sangat kecil (~ 10 mm) dan beroperasi pada tekanan tinggi (Weiss, 1995). HPLC merupakan suatu metode yang sensitif dan akurat untuk penentuan kuantitatif serta baik untuk pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap seperti asam amino, protein, pestisida dan lain-lain.

Pada saat ini, HPLC merupakan metoda kromatografi cair yang pemakaiannya telah sangat berkembang, baik untuk analisis rutin maupun untuk preparatif pada banyak laboratorium. Dibandingkan dengan kromatografi gas, HPLC dioperasikan pada suhu kamar, di mana senyawa yang tidak tahan panas dapat ditentukan dengan mudah dan sifat fasa gerak dapat diubah dengan merubah komposisi dari fasa gerak yang digunakan (Nurhamida, 2005).

4. Jenis-Jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

a. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut.

b. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

c. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

c. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. 

d. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

e. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2. Prinsip HPLC
Adapun prinsip dari HPLC yaitu suatu sampel berupa larutan diinjeksikan kedalam kolom yang berisi fase diam dan fase gerak, kemudian diberikan tekanan tinggi sehingga fase gerak dapat mengelusi sampel keluar dari kolom dan terdeteksi oleh detektor yang kemudian dihasilkan kromatogram (Karlida, 2013).

3. Komponen-Komponen HPLC
Komponen-komponen penting dari HPLC dapat dilihat pada Gambar Blok berikut ini :

1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut
Fase gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat. Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fase gerak, biasanya berbentuk botol kaca dengan selang penghubung.

2. Pompa
Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang digunakan dalam HPLC haruslah pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fase gerak dalam reservoir menuju kolom fase diam dan melewati detektor. Tekanan yang digunakan beragam tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel fase diam, serta laju alir dan komposisi dari fase gerak yang akan dipakai.

3. Injektor
Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC. Proses injeksi dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan menggunakan sistem injeksi otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat menampung sampel cairan dalam kisaran volume 0.1-100 mL

4. Sampel
Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening dan tidak ada endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum dianalisis, misalnya dengan melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti mengatur konsentrasi sampel, desalting, dan lain-lain.

5. Kolom HPLC
Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fase diam. Di dalam kolom akan terjadi pemisahan komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu retensi masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk melewati kolom menuju detektor. Waktu retensi dihitung dari saat sampel diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum pada detektor. Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga masing-masing konsentrasinya dapat dihitung.

6. Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan jumlah komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak (peak) yang dihasilkan. Konsentrasi komponen yang hendak dianalisis dapat dihitung dengan membandingkan luas area peak komponen dengan luas area peak serta konsentrasi standar.

J. Keuntungan dan Kerugian HPLC
Dengan adanya HPLC tentunya sangat membantu dalam proses kromatografi.

a. kelebihan dari alat HPLC antara lain:
  • Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang tinggi. -Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
  • Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
  • Kolom dapat digunakan kembali.
  • Waktu analisa cukup singkat.
  • HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
  • Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
  • Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

K. Kelemahan dari alat HPLC antara lain:
  • Harga sebuah alat HPLC cukup mahal
  • Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
  • Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.