MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY - ElrinAlria
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Teknologi nuklir sekarang ini semakin berkembang seiring dengan meningkatnya pemanfaatan teknologi nuklir dalam berbagai bidang. Hal ini juga didukung dengan semakin berkembangnya teknologi. Salah satu pemanfaatan teknik nuklir yaitu dalam deteksi konsentrasi suatu hormon dengan cara pelabelanhormon radio-isotop spesifik menggunakan aplikasi teknik nuklir dengan teknik Radioimmuno Assay (RIA), untuk mendeteksi hormon progesterone.

RIA merupakan satu cara untuk memberi dukungan dalam rangka peningkatan efisiensireproduksi terutama yang berkaitan dengan adanya kelainan saluran reproduksi, dandilakukan melalui deteksi konsentrasi hormon progesterone dalam serum. RIA (Radioimmunoassay) adalah salah satu teknik immunoassay yang lebih baik dan lebih sensitif. Pada dasarnya, semua prinsip-prinsip desain assay EIA didasarkan pada kesimpulan yang diambil dari penggunaan RIA. Meskipun RIAmasih merupakan teknik yang layak, namun sebagian besar telah digantikan olehCL dan EIA di sebagian besar laboratorium klinis. Berbagai radioisotopdimanfaatkan dalam pemeriksaan RIA,. Baik CL dan EIA memiliki keunggulan pada reagen yang lebih stabil dan dapat memiliki batas deteksi yang lebih sensitif,serta tidak ada masalah dengan pembuangan limbah berbahaya


B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada makalah ini adalah:
  1. Apa pengertian dari radioimmunoassay? 
  2. Bagaimana prinsip kerja dari radioimmunoassay? 
  3. Bagaimana pemanfaatan radioaktivasi? 
  4. Bagaimana pengukuran bound/tracer bebas? 
  5. Bagaimana pemilihan antibodi? 
  6. Bagaimana keuntungan dan kerugian radioimmunoassay? 

C. Tujuan 
Tujuan pada penulisan makalah ini adalah:
  1. Untuk mengetahui pengertian dari radioimmunoassay 
  2. Untuk mengetahui prinsip kerja dari radioimmunoassay 
  3. Untuk mengetahui pemanfaatan radioaktivasi 
  4. Untuk mengetahi pengukuran bound/tracer bebas 
  5. Untuk mengetahi pemilihan antibodi 
  6. Untuk mengetahui keuntungan dan kerugian radioimmunoassay 

D. Manfaat
Manfaat pada penulisan makalah ini adalah:
  1. Agar dapat mengetahui pengertian dari radioimmunoassay 
  2. Agar dapat mengetahui prinsip kerja dari radioimmunoassay 
  3. Agar dapat mengetahui pemanfaatan radioaktivasi 
  4. Agar dapat mengetahui pengukuran bound/tracer bebas 
  5. Agar dapat mengetahui pemilihan antibodi 
  6. Agar dapat mengetahui keuntungan dan kerugian radioimmunoassay 

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian Radiasiimmunoassay (RIA)
Yalow dan Berson mengembangkan teknik radioisotopik pertama untuk belajar volume darah dan metabolisme yodium. Mereka kemudian mengadaptasi metode untuk mempelajari bagaimana tubuh menggunakan hormon, terutama insulin, yang mengatur kadar gula dalam darah. Para peneliti membuktikan bahwa Tipe II (dewasa onset) diabetes disebabkan oleh tidak efisiennya penggunaan insulin. Sebelumnya, diperkirakan bahwa diabetes hanya disebabkan oleh kurangnya insulin.

Pada tahun 1959, teori tersebut disempurnakan Berson Yalow dan teknik pengukuran mereka dan menamakannya radioimmunoassay (RIA). RIA sangat sensitif. Dapat mengukur satu trillionth gram bahan per mililiter darah. Karena sampel yang kecil diperlukan untuk pengukuran, RIA segera menjadi standar alat laboratorium.

Radioimmunoassay merupakan metode laboratorium (in vitro method) untuk mengukur dengan relative tepat jumlah zat yang ada pada tubuh pasien dengan isotop radioaktif yang bercampur dengan antibody yang disisipkan ke dalam sampel. 

B. Prinsip Kerja Radioimmunoassay
Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan reaksi dalam campuran yang terdiri dari antigen/hormon berlabel radioaktif, antibodi dan antigen/hormon yang tidak berlabel radioisotop. Antigen radioaktif dicampur dengan sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama lain menjadi satu zat. Kemudian ditambahkan zat yang tidak diketahui jenisnya yang mengandung sedikit antigen. Zat baru ini merupakan zat yang diuji.

Secara sederhana digambarkan dengan asumsi bahwa antibodi yang dimaksud berkonsentrasi sangat tinggi untuk dikombinasikan dengan antigen atau antigen yang berlabel dalam molekul antibodi. Pada saat ikatan kadar protein dan steroid radioaktif konstan, penghambatan ikatan hormon radioaktif dengan ikatan protein merupakan fungsi dari jumlah hormon nonradioaktif yang berada pada sampel.

Secara ringkas, skema proses pengujian zat dengan teknik radioimmunoassay diperlihatkan pada gambar di bawah ini.
Prinsip Kerja Radioimmunoassay


C. Pemanfaatan Radioaktivasi
Teknik RIA adalah suatu teknik penentuan zat-zat yang berada dalam tubuh berdasarkan reaksi imunologi yang menggunakan tracer radioaktif. Tracer radioaktif adalah isotop radioaktif yang akan meluruh pada melalui proses radioaktivitas. Radioaktivitas adalah proses peluruhan isotop tidak stabil (radioaktif) menjadi isotop yang lebih stabil dengan memancarkan energy melalui materi berupa partikel-partikel (alpha atau beta) ataupun gelombang elektromagnetik (sinar gamma)[4]. Intensitas dari sumber radioaktif dinyatakan oleh transformasi inti rata-rata per satuan waktu. Satuan radioaktivitas dinyatakan dengan Curie (Ci). 1 Ci awalnya didefinisikan sebagai radiasi yang dipancarkan oleh 1 gram Ra, tetapi definisi ini diubah sebagai kemurnian dari peningkatan nuklida. Nilai absolute dari 1 Ci sama dengan 3,7×1010 disintegrasi/sekon. Satuan lain dari radioaktivitas adalah Becquerel (Bq), 1 Bq sama dengan 1 disintegrasi/sekon.

RIA memiliki 2 keampuhan metode antara lain adalah: Pertama, pengukuran radioaktivitas memberikan kepekaan dan ketelitian yang tinggi serta tidak terpengaruh oleh faktor-faktor lain yang terdapat dalam sistem. Kedua, reaksi immunologi berlangsung secara spesifik karena antigen hanya dapat bereaksi dengan antibody yang sesuai dengannya sehingga zat lain atau antigen lain yang tidak sesuai karakteristiknya tidak dapat ikut campur dalam reaksi.

D. Pengukuran Bound/Tracer Bebas
Pengukuran Bound/Tracer Bebas RADIOIMMUNOASSAY


  • Sejak B + F = Ag * = konstan, pengukuran baik B atau F cukup.
  • Biasanya, B diukur dengan penangkapan kompleks Ag-Ab. Hal ini dapat dicapai dengan solid-fase sekunder Ab atau dengan pembentukan kisi dalam larutan.
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY


Tujuan dari pengukuran ini adalah untuk menentukan jumlah optimal antibodi yang digunakan, biasanya cukup untuk mengikat sekitar 50% dari ditambahkan tracer (yang sama di masing-masing tabung).

MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY


Tujuan dari pengukuran menggunakan kurva ini yaitu untuk membangun sebuah kurva penghambatan yang mengikat berdasarkan standar jumlah antigen, untuk digunakan dalam interpolasi sampel yang tidak diketahui.
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY


E. Pemilihan Antibodi
Terdapat 2 antibodi yang dapat digunakan dalam melakukan radiasiimmunoassay diantaranya:

1. Molekul internal berlabel
Biasanya, tritium (3H) adalah label, kadang-kadang 14C. Biasanya dibeli secara komersial. Hanya digunakan untuk molekul kecil seperti steroid atau obat. Keuntungannya yaitu pelacak imunologis berperilaku persis seperti hormon dingin, sehingga secara teoritis sempurna.

Sedangkan kerugiannya adalah beta-radiasi lemah dan karena itu lebih sulit untuk mengukur, sehingga praktis rumit. Sinar beta memiliki daya penetrasi rendah, sehingga sampel radioaktif perlu dicampur dengan kilau sebuah cairan dan cahaya yang dihasilkan diukur dengan menggunakan photomultiplier ("beta-counter").

2. Molekul eksternal berlabel
Biasanya, 125I adalah label. Keuntungannya adalah sering diproduksi di laboratorium penelitian itu sendiri, gamma-radiasi telah tinggi menembus listrik oleh karena itu mudah untuk mengukur, sehingga praktis untuk digunakan. Sedangkan kekurangannya adalah pelacak imunologis tidak selalu berperilaku persis seperti hormon dingin, karena iodinasi kerusakan, kehidupan rak-protein iodinasi adalah <4 minggu. Biasanya, akan mengambil tempat dari atom hidrogen pada pada cincin dari tirosin dan kadang-kadang, molekul berlabel radioaktif perlu konjugasi protein.

F. Keuntungan dan Kerugian Radiimmunoasaay
Keuntungan dan kerugian dari radioimmunoassay yaitu fleksibilitas yang artinya menggunakan prinsip yang sama, hampir biomolekul apapun dapat diuji dengan cepat (biasanya 2 hari atau kurang), sensitif (sebanding dengan yang paling sensitif bioassay, yaitu <ng / ml), kapasitas besar: ribuan sampel / hari spesifik (antibodi-bergantung). Sedangkan kerugiannya yaitu penggunaan radioaktivitas dapat berbahaya dan peralatan yang digunakan mahal (gamma atau beta counter).

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Kesimpulan pada makalah ini adalah:
  1. Radioimmunoassay adalah metode laboratorium (in vitro method) untuk mengukur dengan relative tepat jumlah zat yang ada pada tubuh pasien dengan isotop radioaktif yang bercampur dengan antibody yang disisipkan ke dalam sampel. 
  2. Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan reaksi dalam campuran yang terdiri dari antigen/hormon berlabel radioaktif, antibodi dan antigen/hormon yang tidak berlabel radioisotop. Antigen radioaktif dicampur dengan sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama lain menjadi satu zat. Kemudian ditambahkan zat yang tidak diketahui jenisnya yang mengandung sedikit antigen. Zat baru ini merupakan zat yang diuji. 
  3. RIA memiliki 2 keampuhan metode antara lain adalah: Pertama, pengukuran radioaktivitas memberikan kepekaan dan ketelitian yang tinggi serta tidak terpengaruh oleh faktor-faktor lain yang terdapat dalam sistem. Kedua, reaksi immunologi berlangsung secara spesifik karena antigen hanya dapat bereaksi dengan antibody yang sesuai dengannya sehingga zat lain atau antigen lain yang tidak sesuai karakteristiknya tidak dapat ikut campur dalam reaksi. 
  4. Pengukuran bound/tracer bebas dapat digunakan menggunakan kurva antibodi-dilusi dan kurva standar 
  5. Pemilihan antibodi dapat dilakukan dengan molekul internal berlabel dan molekul ekstrerna berlabel 
  6. Keuntungan dan kerugian dari radioimmunoassay yaitu fleksibilitas yang artinya menggunakan prinsip yang sama, hampir biomolekul apapun dapat diuji dengan cepat (biasanya 2 hari atau kurang), sensitif (sebanding dengan yang paling sensitif bioassay, yaitu <ng / ml), kapasitas besar: ribuan sampel / hari spesifik (antibodi-bergantung). Sedangkan kerugiannya yaitu penggunaan radioaktivitas dapat berbahaya dan peralatan yang digunakan mahal (gamma atau beta counter).

MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY

MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Teknologi nuklir sekarang ini semakin berkembang seiring dengan meningkatnya pemanfaatan teknologi nuklir dalam berbagai bidang. Hal ini juga didukung dengan semakin berkembangnya teknologi. Salah satu pemanfaatan teknik nuklir yaitu dalam deteksi konsentrasi suatu hormon dengan cara pelabelanhormon radio-isotop spesifik menggunakan aplikasi teknik nuklir dengan teknik Radioimmuno Assay (RIA), untuk mendeteksi hormon progesterone.

RIA merupakan satu cara untuk memberi dukungan dalam rangka peningkatan efisiensireproduksi terutama yang berkaitan dengan adanya kelainan saluran reproduksi, dandilakukan melalui deteksi konsentrasi hormon progesterone dalam serum. RIA (Radioimmunoassay) adalah salah satu teknik immunoassay yang lebih baik dan lebih sensitif. Pada dasarnya, semua prinsip-prinsip desain assay EIA didasarkan pada kesimpulan yang diambil dari penggunaan RIA. Meskipun RIAmasih merupakan teknik yang layak, namun sebagian besar telah digantikan olehCL dan EIA di sebagian besar laboratorium klinis. Berbagai radioisotopdimanfaatkan dalam pemeriksaan RIA,. Baik CL dan EIA memiliki keunggulan pada reagen yang lebih stabil dan dapat memiliki batas deteksi yang lebih sensitif,serta tidak ada masalah dengan pembuangan limbah berbahaya


B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah pada makalah ini adalah:
  1. Apa pengertian dari radioimmunoassay? 
  2. Bagaimana prinsip kerja dari radioimmunoassay? 
  3. Bagaimana pemanfaatan radioaktivasi? 
  4. Bagaimana pengukuran bound/tracer bebas? 
  5. Bagaimana pemilihan antibodi? 
  6. Bagaimana keuntungan dan kerugian radioimmunoassay? 

C. Tujuan 
Tujuan pada penulisan makalah ini adalah:
  1. Untuk mengetahui pengertian dari radioimmunoassay 
  2. Untuk mengetahui prinsip kerja dari radioimmunoassay 
  3. Untuk mengetahui pemanfaatan radioaktivasi 
  4. Untuk mengetahi pengukuran bound/tracer bebas 
  5. Untuk mengetahi pemilihan antibodi 
  6. Untuk mengetahui keuntungan dan kerugian radioimmunoassay 

D. Manfaat
Manfaat pada penulisan makalah ini adalah:
  1. Agar dapat mengetahui pengertian dari radioimmunoassay 
  2. Agar dapat mengetahui prinsip kerja dari radioimmunoassay 
  3. Agar dapat mengetahui pemanfaatan radioaktivasi 
  4. Agar dapat mengetahui pengukuran bound/tracer bebas 
  5. Agar dapat mengetahui pemilihan antibodi 
  6. Agar dapat mengetahui keuntungan dan kerugian radioimmunoassay 

BAB II
PEMBAHASAN
A. Pengertian Radiasiimmunoassay (RIA)
Yalow dan Berson mengembangkan teknik radioisotopik pertama untuk belajar volume darah dan metabolisme yodium. Mereka kemudian mengadaptasi metode untuk mempelajari bagaimana tubuh menggunakan hormon, terutama insulin, yang mengatur kadar gula dalam darah. Para peneliti membuktikan bahwa Tipe II (dewasa onset) diabetes disebabkan oleh tidak efisiennya penggunaan insulin. Sebelumnya, diperkirakan bahwa diabetes hanya disebabkan oleh kurangnya insulin.

Pada tahun 1959, teori tersebut disempurnakan Berson Yalow dan teknik pengukuran mereka dan menamakannya radioimmunoassay (RIA). RIA sangat sensitif. Dapat mengukur satu trillionth gram bahan per mililiter darah. Karena sampel yang kecil diperlukan untuk pengukuran, RIA segera menjadi standar alat laboratorium.

Radioimmunoassay merupakan metode laboratorium (in vitro method) untuk mengukur dengan relative tepat jumlah zat yang ada pada tubuh pasien dengan isotop radioaktif yang bercampur dengan antibody yang disisipkan ke dalam sampel. 

B. Prinsip Kerja Radioimmunoassay
Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan reaksi dalam campuran yang terdiri dari antigen/hormon berlabel radioaktif, antibodi dan antigen/hormon yang tidak berlabel radioisotop. Antigen radioaktif dicampur dengan sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama lain menjadi satu zat. Kemudian ditambahkan zat yang tidak diketahui jenisnya yang mengandung sedikit antigen. Zat baru ini merupakan zat yang diuji.

Secara sederhana digambarkan dengan asumsi bahwa antibodi yang dimaksud berkonsentrasi sangat tinggi untuk dikombinasikan dengan antigen atau antigen yang berlabel dalam molekul antibodi. Pada saat ikatan kadar protein dan steroid radioaktif konstan, penghambatan ikatan hormon radioaktif dengan ikatan protein merupakan fungsi dari jumlah hormon nonradioaktif yang berada pada sampel.

Secara ringkas, skema proses pengujian zat dengan teknik radioimmunoassay diperlihatkan pada gambar di bawah ini.
Prinsip Kerja Radioimmunoassay


C. Pemanfaatan Radioaktivasi
Teknik RIA adalah suatu teknik penentuan zat-zat yang berada dalam tubuh berdasarkan reaksi imunologi yang menggunakan tracer radioaktif. Tracer radioaktif adalah isotop radioaktif yang akan meluruh pada melalui proses radioaktivitas. Radioaktivitas adalah proses peluruhan isotop tidak stabil (radioaktif) menjadi isotop yang lebih stabil dengan memancarkan energy melalui materi berupa partikel-partikel (alpha atau beta) ataupun gelombang elektromagnetik (sinar gamma)[4]. Intensitas dari sumber radioaktif dinyatakan oleh transformasi inti rata-rata per satuan waktu. Satuan radioaktivitas dinyatakan dengan Curie (Ci). 1 Ci awalnya didefinisikan sebagai radiasi yang dipancarkan oleh 1 gram Ra, tetapi definisi ini diubah sebagai kemurnian dari peningkatan nuklida. Nilai absolute dari 1 Ci sama dengan 3,7×1010 disintegrasi/sekon. Satuan lain dari radioaktivitas adalah Becquerel (Bq), 1 Bq sama dengan 1 disintegrasi/sekon.

RIA memiliki 2 keampuhan metode antara lain adalah: Pertama, pengukuran radioaktivitas memberikan kepekaan dan ketelitian yang tinggi serta tidak terpengaruh oleh faktor-faktor lain yang terdapat dalam sistem. Kedua, reaksi immunologi berlangsung secara spesifik karena antigen hanya dapat bereaksi dengan antibody yang sesuai dengannya sehingga zat lain atau antigen lain yang tidak sesuai karakteristiknya tidak dapat ikut campur dalam reaksi.

D. Pengukuran Bound/Tracer Bebas
Pengukuran Bound/Tracer Bebas RADIOIMMUNOASSAY


  • Sejak B + F = Ag * = konstan, pengukuran baik B atau F cukup.
  • Biasanya, B diukur dengan penangkapan kompleks Ag-Ab. Hal ini dapat dicapai dengan solid-fase sekunder Ab atau dengan pembentukan kisi dalam larutan.
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY


Tujuan dari pengukuran ini adalah untuk menentukan jumlah optimal antibodi yang digunakan, biasanya cukup untuk mengikat sekitar 50% dari ditambahkan tracer (yang sama di masing-masing tabung).

MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY


Tujuan dari pengukuran menggunakan kurva ini yaitu untuk membangun sebuah kurva penghambatan yang mengikat berdasarkan standar jumlah antigen, untuk digunakan dalam interpolasi sampel yang tidak diketahui.
MAKALAH RADIOIMMUNOASSAY


E. Pemilihan Antibodi
Terdapat 2 antibodi yang dapat digunakan dalam melakukan radiasiimmunoassay diantaranya:

1. Molekul internal berlabel
Biasanya, tritium (3H) adalah label, kadang-kadang 14C. Biasanya dibeli secara komersial. Hanya digunakan untuk molekul kecil seperti steroid atau obat. Keuntungannya yaitu pelacak imunologis berperilaku persis seperti hormon dingin, sehingga secara teoritis sempurna.

Sedangkan kerugiannya adalah beta-radiasi lemah dan karena itu lebih sulit untuk mengukur, sehingga praktis rumit. Sinar beta memiliki daya penetrasi rendah, sehingga sampel radioaktif perlu dicampur dengan kilau sebuah cairan dan cahaya yang dihasilkan diukur dengan menggunakan photomultiplier ("beta-counter").

2. Molekul eksternal berlabel
Biasanya, 125I adalah label. Keuntungannya adalah sering diproduksi di laboratorium penelitian itu sendiri, gamma-radiasi telah tinggi menembus listrik oleh karena itu mudah untuk mengukur, sehingga praktis untuk digunakan. Sedangkan kekurangannya adalah pelacak imunologis tidak selalu berperilaku persis seperti hormon dingin, karena iodinasi kerusakan, kehidupan rak-protein iodinasi adalah <4 minggu. Biasanya, akan mengambil tempat dari atom hidrogen pada pada cincin dari tirosin dan kadang-kadang, molekul berlabel radioaktif perlu konjugasi protein.

F. Keuntungan dan Kerugian Radiimmunoasaay
Keuntungan dan kerugian dari radioimmunoassay yaitu fleksibilitas yang artinya menggunakan prinsip yang sama, hampir biomolekul apapun dapat diuji dengan cepat (biasanya 2 hari atau kurang), sensitif (sebanding dengan yang paling sensitif bioassay, yaitu <ng / ml), kapasitas besar: ribuan sampel / hari spesifik (antibodi-bergantung). Sedangkan kerugiannya yaitu penggunaan radioaktivitas dapat berbahaya dan peralatan yang digunakan mahal (gamma atau beta counter).

BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
Kesimpulan pada makalah ini adalah:
  1. Radioimmunoassay adalah metode laboratorium (in vitro method) untuk mengukur dengan relative tepat jumlah zat yang ada pada tubuh pasien dengan isotop radioaktif yang bercampur dengan antibody yang disisipkan ke dalam sampel. 
  2. Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan reaksi dalam campuran yang terdiri dari antigen/hormon berlabel radioaktif, antibodi dan antigen/hormon yang tidak berlabel radioisotop. Antigen radioaktif dicampur dengan sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama lain menjadi satu zat. Kemudian ditambahkan zat yang tidak diketahui jenisnya yang mengandung sedikit antigen. Zat baru ini merupakan zat yang diuji. 
  3. RIA memiliki 2 keampuhan metode antara lain adalah: Pertama, pengukuran radioaktivitas memberikan kepekaan dan ketelitian yang tinggi serta tidak terpengaruh oleh faktor-faktor lain yang terdapat dalam sistem. Kedua, reaksi immunologi berlangsung secara spesifik karena antigen hanya dapat bereaksi dengan antibody yang sesuai dengannya sehingga zat lain atau antigen lain yang tidak sesuai karakteristiknya tidak dapat ikut campur dalam reaksi. 
  4. Pengukuran bound/tracer bebas dapat digunakan menggunakan kurva antibodi-dilusi dan kurva standar 
  5. Pemilihan antibodi dapat dilakukan dengan molekul internal berlabel dan molekul ekstrerna berlabel 
  6. Keuntungan dan kerugian dari radioimmunoassay yaitu fleksibilitas yang artinya menggunakan prinsip yang sama, hampir biomolekul apapun dapat diuji dengan cepat (biasanya 2 hari atau kurang), sensitif (sebanding dengan yang paling sensitif bioassay, yaitu <ng / ml), kapasitas besar: ribuan sampel / hari spesifik (antibodi-bergantung). Sedangkan kerugiannya yaitu penggunaan radioaktivitas dapat berbahaya dan peralatan yang digunakan mahal (gamma atau beta counter).