LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH METODE BSLT SECARA BIOASSAY - ElrinAlria
LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH (JATROPHA GOSSYPIFOLIA) METODE  BRINE SHIRMP LETHALITY (BSLT) SECARA BIOASSAY

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Uji toksisitas menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), pada larva udang Artemia salina Leach sebagai hewan percobaan. Pengujian dengan larva udang ini merupakan skrining awal untuk senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antikanker. Hasil uji toksisitas dengan metoda BSLT dapat diketahui dari jumlah kematian larva udang Artemia salina Leach karena pengaruh ekstrak atau senyawa tertentu dari dosis yang telah ditentukan.

Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsip uji toksisitas adalah bahwa komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya sehingga banyak digunakan dalam uji toksisitas. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungan akan terserap ke dalam tubuh secara difusi dan langsung memengaruhi kehidupannya. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing tersebut bersifat toksik. Uji toksisitas digunakan untuk mengetahui pengaruh racun yang dihasilkan oleh dosis tunggal dari suatu campuran zat kimia.

Salah satu metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik adalah dengan uji toksisitas terhadap larva udang dari Artemia Salina Leach (Brine Shrimp Lethality Test). Metode ini sering digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak perlu kondisi aseptis) dan dapat dipercaya.

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan suatu metoda yang digunakan untuk menguji bahan-bahan yang bersifat toksik. Toksisitas didefinisikan sebagai kemampuan suatu zat yang memiliki sifat destruktif pada sel terutama yang menyangkut proses suatu sel dalam sistem kekebalan tubuh.

B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah yang terdapat dalam percobaan ini yaitu bagaimana cara menentukan nilai toksisitas ekstrak menggunakan metode BSLT?

C. Tujuan 
Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara menentukan nilai toksisitas ekstrak menggunakan metode BSLT

D. Manfaat
Manfaat dari percobaan ini yaitu mampu memberikan informasi cara menentukan nilai toksisitas ekstrak menggunakan metode BSLT

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Salah satu metode awal untuk uji sitotoksik adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. Metode BSLT telah terbukti memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat, dan cukup akurat, Uji toksisitas dilakukan dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach yang berumur 48 jam. Efek toksik ekstrak diidentifikasi dengan presentase kematian larva udang menggunakan analisis probit (LC50) (Muaja A. D., dkk., 2013).

Pengujian toksisitas diakukan dengan menggunakan metode BSLT (brine shrimp lethality test) dengan larva udang Artemia salina Leach. Metode BSLT dipilih dengan berbagai alasan. Alasan petama, metode ini merupakan metode penapisan farmakologi awal yang mudah dan relatife tidak mahal. Kedua, metode ini merupakan metode yang telah teruji hasilnya dngan tingkat kepercayaan 95% untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak kasar dan yang keempat metode ini sering dikaitkan sebagai metode penapisan untuk penyarian senyawa antikanker dari tanaman. Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungannya akan terserap kedalam tubuh dengan cara difusi dan langsung mempengaruhi kehidupan larva udag tersebut. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing tersebut bersifat toksik (Devi Anggraeni S dan Erwin., 2015).

Metode uji toksisitas dapat dilakukan secara in vitro maupun in vivo. Salah satu metode toksisitas in vitro yang sering digunakan adalah metode Brine Shrimp Letality Test (BSLT). Metode BSLT merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk skrining toksisitas dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach. Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spektrum aktivitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat dipercaya. Di samping itu, metode ini sering dikaitkan dengan metode penapisan senyawa antikanker (Frengki, 2014).

Penetasan telur Artemia salina Lench dapat dilakukan dengan menggunakan air laut buatan yang dilengkapi dengan aerator dan lampu. Air laut yang digunakan harus memiliki kisaran pH 8-9 karena penetasan tidak akan terjadi jika pH kurang dari 7. Pada pH 8-9, enzim penetas mempunyai aktivitas optimum sehingga terjadi proses pecahnya lapisan tipis pada telur. Penyinaran saat proses penetasan berfungsi untuk menghangatkan suhu air tersebut. Selain itu, adanya cahaya dapat merangsang pengaktifan kembali perkembangan embrio Artemia salina. Aerator harus selalu dinyalakan selama proses penetasan agar selalu terpenuhinya kebutuhan akan oksigen dan mencegah terjadinya pengendapan kista-kista di dasar wadah penetasan. Pengendapan kista-kista dapat menimbulkan kondisi anaerob sehingga perkembangan embrio menjadi terhambat (Retno Prasetia dan iis intan w, 2013)

Salah satu metode awal yang sering dipakai untult mengamati toksisitas senyawa dan inerupakan metode penapisan untuk aktivitas antikanker senyawa kimia dalam ekstrak tanaman adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), dengan menggunakan cara Meyer. Metode ini ditujukan terhadap tingltat mortalitas larva udang Artemia salina L. yang disebabkan oleh ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dihitung sebagai nilai LC50 (Letal concentration) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis atau konsentrasi ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50% setelah masa inkubasi 24 jam (Lisdawati V., dkk., 2006).

BAB III 
METODE KERJA
A. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum’at, tanggal 30 Desember 2016, Pukul 08.00-11.30 WITA. Bertempat di Laboratorium Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Halu Oleo, Kendari.

B. Alat dan Bahan
1. Alat 
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Botol vial
  • Batang pengaduk
  • Gelas kimia 100 ml, 500 ml
  • Gelas ukur 50 ml, 100 ml, 250 ml
  • Labu takar 50 ml, 100 ml
  • Pipet tetes
  • Spatula 
  • Timbangan analitik

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Air laut
  • Aquades
  • Ekstrak jarak merah
  • Etanol
  • Larva udang
  • Tissue

C. Uraian Bahan
1. Aquades (Ditjen POM, 1979 : 96)
Nama Resmi : Aqua Destillata
Nama Lain : Aquades, Air Suling 
Rumus Molekul : H2O
Gambar Struktur :
Berat Molekul : 18,02 g/mol
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak mempunyai rasa
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup 
Kegunaan : Pelarut

2. Etanol (Ditjen POM, 1979 : 65) 
Nama Resmi : Aethanolum
Nama Lain : Alkohol, etanol
Rumus Molekul : C2H5OH
Berat Molekul : 46,07 g/mol
Gambar Struktru : 
Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap dan mudah bergerak, bau khas, rasa panas. Mudah terbakar dengan memberikan nyala biru yang tidak berasap. 
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, dalam kloroform P, dan dalam eter P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, ditempat sejuk, jauh dari nyala api
Kegunaan : Antiseptik

D. Uraian Hewan Coba
1. Klasifikasi Larva Udang (Mudjiman, 1998)
Filum : Arthopoda
Divisio : Crustaceae
Subdivisio : Branchiopoda 
Ordo : Anostraca
Famili : Artemiidae
Genus : Artemia
Species : Artemia salina

2. Morfologi (Mudjiman, 1998)
Udang (Artemia salina) mengalami beberapa fase hidup, tetapi secara jelas dapat dilihat dalam tiga bentuk yang sangat berlainan, yaitu bentuk telur, larva (nauplii) dan artemia dewasa. Telur yang baru dipanen dari alam berbentuk bulat dengan ukuran 0,2-0,3 mm. Telur yang menetas akan berubah menjadi larva. Telur yang baru menetas ini berukuran kurang lebih 300 µ. Dalam pertumbuhannya larva mengalami 15 kali perubahan bentuk yang merupakan satu tingkatan hidup, setelah itu berubah menjadi artemia dewasa.

Waktu yang diperlukan sampai menjadi artemia dewasa umumnya sekitar 2 minggu. Berbentuk silinder dengan panjang 12-15 mm. Tubuh terbagi atasl bagian kepala, dada dan perut. Pada bagian kepala terdapat 2 tangkai mata, 2 antena dan dua antenula. Dada terbagi atas 12 segmen yang masing-masing mempunyai sepasang kaki renang. Perut ternagi atas 8 segmen. Dapat hidup dalam air dengan suhu 25o-30oC dan pH sekitar 8-9. 

3. Uraian Tentang Larva (Mudjiman, 1998)
Telur-telur yang kering direndam dalam air laut yang bersuhu 25oC akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Burayak tingkat I dinamakan instar, tingkat II instar II, tingkat III Instar III, demikian seterusnya sampai Instar XV. Setelah itu berubahlah mereka menjadi artemia dewasa.

Burayak yang baru saja menetas masih dalam tingkat Instar I bentuknya bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron (0,4 mm) dan beratnya 15 mikrogram. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu, mereka masih belum perlu makanan.

Anggota badannya terdiri dari sungut kecil (antenula atau antena I dan sepasang sungut besar (antenna II). Dibagian depan diantara kedua sungut kecilnya terdapat bintik merah yang tidak lain adalah mata naupliusnya (oselus). Dibelakang sungut besar terdapat sepasang mandibula (rahang) dan rudimenter kecil. Sedangkan dibagian perur (ventral) sebelah depan terdapatlah labrum.

Pada pangkal sungut besar (antena II) terdapat bangunan seperti duri yang menghadap ke belakang (gnotobasen seta) bangunan ini merupakan cirri khusus untuk membedakan burayak instar I, instar II dan instar III. Pada burayak instar I (baru menetas) gnotobasen setanya masih belum berbulu dan juga belum bercabang. 

Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II. Lebih lama lagi akan berubah menjadi instar III.Pada tingkatan II, gnotobasen setanya sudah berbulu tapi masih belum bercabang. Sedangkan pada instar III, selain berbulu gnotobasen seta tersebut sudah bercabang II.

Pada tingkatan instar II, burayak mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari makan, bersamaan dengan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya dengan cara menggerak-gerakkan antena II-nya. Selain itu untuk mengumpulkan makanan antena II juga berfungsi untuk bergerak. Tubuh instar II dan instar III sudah lebih panjang dari instar I.

Pada tingkatan selanjutnya, disebelah kanan dan kiri mata nauplius mulai terbentuk sepasang mata majemuk. Mula-mula masih belum bertangkai. Kemudian secara berangsur-angsur berubah menjadi bertangkai. Selain itu, dibagian samping badannya (kanan dan kiri) juga berangsur-angsur tumbuh tunas kakinya (torakopada). Mula-mula tumbuh dibagian depan kemudian berturut-turut disusul oleh bagian-bagian yang lebih ke belakang. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah masa burayak, dan berubah menjadi artemia dewasa.

E. Uraian Tanaman 
1. Klasifikasi Jarak Merah (Jatropha gossypifolia) (Hossain, 2008).
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae
Ordo : Euphobiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Jatropha
Spesies : Jatropha gossypifolia L. 

2. Morfologi Tanaman
Jatropha gossypifolia (Linn) merupakantumbuhan semak yang tegak atau pohon kecil, biasanya tinggi sekitar 2,5 m tetapi yang dapat melebihi 4 m di beberapa daerah. Beberapa spesimen memiliki satu batang, sedangkan yang lain dapat memiliki dua atau lebih batang. Batang yang tebal, agak lunak, kasar, berbulu, panjang 1-2 m danmemiliki getah berair ketika luka. Batang kenaikan dari mahkota herba. Daun yang belum matang akan berwarna ungu dan lengket, daun yang lebih tua umumnya hijau mengkilap meskipun beberapa mungkin memiliki pewarnaan ungu. Bunga-bunga berwarna ungu / merah dengan pusat kuning dan diproduksi dalam kelompok pada percabangan batang di axils daun bagian atas. Buah berbentuk kapsul (biji polong) adalah sub-globular (bulat agak lonjong), panjang sekitar 12 mm dan lebar 10 mm.

F. Prosedur Kerja
LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH (JATROPHA GOSSYPIFOLIA) METODE  BRINE SHIRMP LETHALITY (BSLT) SECARA BIOASSAY

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan
1. Tabel Pengamatan
LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH (JATROPHA GOSSYPIFOLIA) METODE  BRINE SHIRMP LETHALITY (BSLT) SECARA BIOASSAY


B. Pembahasan
Bioassay adalah penggunakan organism uji untuk mengukur infektifitas relative patogen atau toksisitas zat. Kanamicin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida yang bekerja menghambat proses sintesis protein mikroorganisme.

Toksikologi adalah ilmu yang menetapkan batas aman dari bahan kimia. Selain itu toksikologi juga mempelajari jelas/kerusakan/ cedera pada organisme (hewan, tumbuhan, manusia) yang diakibatkan oleh suatu materi substansi/energi, mempelajari racun, tidak saja efeknya, tetapi juga mekanisme terjadinya efek tersebut pada organisme dan mempelajari kerja kimia yang merugikan terhadap organisme.

Uji toksisitas merupakan pengujian yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan efek umum suatu senyawa pada hewan coba. Tipe uji toksisitas terbagi menjadi dua, yaitu uji tokisitas umum dan uji toksisitas khusus. Uji toksisitas umum terbagi lagi menjadi tiga, yaitu uji toksisitas akut, uji toksisitas jangka pendek (subakut/subkronik), dan uji toksisitas jangka panjang. Sedangkan uji toksisitas khusus mencakup uji karsinogenesis, mutagenesis, teratogenesis, dan imunotoksikologi.
Jarak pagar (Jatropha curcas L) merupakan salah satu tanaman yang dimanfaatkan untuk mengobati berbagai penyakit, salah satunya adalah penyakit kanker. Daun jarak pagar mengandung senyawa metabolit sekunder berupa flavonoid, saponin, tannin, polifenol, triterpenoid, steroid, dan glikosida, sehingga perlu dilakukan uji toksisitas pendahuluan dan uji antioksidan untuk mengetahui potensinya sebagai antikanker. 

Brine Shirmp Lethality Test (BSLT) merupakan uji pendahuluan yang mengarah pada uji sitotoksik senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan larva udang Artemia salinaLeach sebagai hewan uji yang bertujuan untuk menguji ekstrak tumbuhan yang memiliki sifat toksik. Korelasinya adalah jika mortalitas terhadap A. salinaLeach yang ditimbulkan memiliki harga LC50 ˂ 1000 μg/mL. Beberapa kelebihan dari Brine ShirmpLethality Test (BSLT) ini adalah mudah dan relatif tidak mahal serta tidak membutuhkan suatu spesialisasi tertentu dalam pelaksanaannya. Metode ini juga merupakan metode yang telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaan 95% untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak tanaman.

Lethal Concentration 50 (LC50) yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian sebanyak 50% dari organisme uji ayang dapat diestimasi dengan grafik dan perhitungan, pada suatu waktu pengamatan tertentu, misalnya LC50 48 jam, LC50 96 jam, sampai waktu hidup hewan uji. Lethal Concentration 50 atau biasa disingkat LC50 adalah suatu perhitungan untuk menentukan keaktifan dari suatu ekstrak atau senyawa. Makna LC50 adalah pada konsentrasi berapa ekstrak dapat mematikan 50 % dari organisme uji, misalnya larva Artemia salina (brine shrimp).

Penentuan konsentrasi yang berbeda merupakan langkah dengan menyiapkan konsentrasi dari masing-masing sampel yaitu konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml untuk membandingkan toksisitas dan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut. Juga untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang mengalami LC50. air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan bukan dari laut. digunakan karena tanaman tersebut memiliki khasiat sebagai obat antikanker, dan alasan digunakannya larva udang dalam percobaan ini adalah karena larva udang merupakan general biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk melalui dinding sel larva tersebut. Pra perlakuan merupakan langkah pertama yakni menyiapkan larva udangnya. Pertama-tama Kista udang Artemia Salina leach dimasukkan kedalam wadah penetasan yang berisi air laut dan telah dilengkapi dengan aerator dan lampu. Biarkan 48 jam hingga menjadi larva. Setelah itu membuat larutan sampel dengan masing-masing konsentrasi. Hal pertama yang dilakukan adalah Sampel Jarak merah (Jatropha gossypifolia) 0,5 g dilarutkan dalam 500 ml aquades (larutan induk 1000 μg/ml) kemudian diencerkan untuk dibuat beberapa konsentrasi (4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm). Setelah itu, dimasukkan ke dalam botol vial dan keringkan. Lalu, dipipet 10 ml air laut di botol vial, dimasukkan 10 ekor larva Artemia Salina L, dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan dihitung nilai LC50. 

Diperoleh jumlah larva yang mati dari hasil rata – rata botol I, botol II, dan botol III masing-masing yaitu 8, 7, 7, 6, 5, 5, 4, 3, 3, dan 3 dengan nilai mortalitas 80 %, 70 %, 70 %. 60 %, 50 %, 50 %, 40 %, 30 %, 30 %, dan 30 %. Setelah didapat log konsentrasi diperoleh persaman regresi yaitu y= 0,011x + 41,53. Dengan perolehan nilai LC50 adalah 4,3 x 1014 μg/ml. Artinya konsentrasi larutan sampel yang menyebabkan kematian dengan nilai LC50 adalah konsentarsi 4,3 x 1014 μg/ml. Angka kematian hewan coba dihitung sebagai Median Lethal Dose (LD50) atau Median Lathal Concentration (LC50). Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan coba secara inhalasi atau menggunakan media air. Kematian pada hewan percobaan digunakan sebagai pedoman untuk memperkirakan dosis kematian pada manusia.
Uji Toksisitas Akut merupakan bagian dari Uji Toksisitas Kuantitatif yang dilakukan dalam jangka waktu yang singkat sebagai akibat dari pemaparan jangka pendek terhadap suatu bahan. Efek akut dapat terjadi dalam selang waktu beberapa jam, hari atau minggu. Hal ini yang membuat uji toksisitas ini tergolong uji toksisitas akut.

Plot probabilitas adalah teknik grafis untuk membandingkan dua set data, baik dua set pengamatan empiris, satu set empiris terhadap seperangkat teori, atau (lebih jarang) dua set teoritis terhadap satu sama lain. Sedangkan, Mortalitas adalah jumlah individu dalam populasi yang mati selama periode waktu tertentu. 

BAB V
PENUTUP
A. kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan disimpulkan bahwa dari beberapa konsentrasi yang telah di buat konsentrasi untuk mematikan 50% larva udang (Artemia salina) yaitu pada konsentrasi 250 dan 125 ppm. Sehingga ekstrak kulit batang jarak pagar (Jatropa gosyypholia L.) bersifat toksik dan memungkinkan penggunaannya dalam keamanan sediaan farmasi atau bahan alam dengan nilai LC50 dari ekstrak kulit batang jarak pagar (Jatropa gosyypholia L.) adalah 129 mg/L.

B. Saran
Sebaiknya dalam pengerjaan sampel maupun pengujian dilakukan lebih aseptis lagi dan lebih teliti lagi untuk mendapatkan hasil pengujian yang lebih baik, serta kelengkapan alat praktikum sebagai penunjang pada pengujian ini sebaiknya dilengkapi agar waktu pengujian tidak tertunda. 

DAFTAR PUSTAKA
Anggraeni D. S. dan Erwin., 2015, Uji Fitokimia dan Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) Ekstrak Daun Kelakai (Stenochlaena palustris), Program Studi Kimia FMIPA Universitas Mulawarman, samarinda, Indonesia.

Ditjen POM, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Ditjen POM, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Frengki, Roslizawaty, dan Desi Pertiwi., 2014, Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Sarang Semut Lokal Aceh (Mymercodia Sp.) Dengan Metode Bslt Terhadap Larva Udang Artemia Salina Leach, Jurnal Medika Veterinaria, Vol. 8 No. 1.

Lisdawati V. S., Umali Wiryowida Vol. 8 No. 1. gdo, dan L.Broto S. kardon., 2006, Brine Shrimp Lethality Test (Bslt) Dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah Dan Kulit Biji Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa), jurnal Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 34, No. 3.

Muaja A. D., Harry S. J. Koleangan., dan Max R. J. Runtuwene., 2013, Uji Toksisitas dengan Metode BSLT dan Analisis Kandungan Fitokimia Ekstrak Daun Soyogik (Saurauia bracteosa DC) dengan Metode Soxhletasi, Jurnalmipa Unsrat Online 2(2).

Mudjiman, A., 1998, Udang Renik Air Asin, Bhrata Karya Aksara, Jakarta.

Prasetia R., dan Iis intan W., 2013, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Lakum (Cayratia Tryfolia) Terhadap Larva Artemia Salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).

LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH METODE BSLT SECARA BIOASSAY

LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH (JATROPHA GOSSYPIFOLIA) METODE  BRINE SHIRMP LETHALITY (BSLT) SECARA BIOASSAY

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Uji toksisitas menggunakan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), pada larva udang Artemia salina Leach sebagai hewan percobaan. Pengujian dengan larva udang ini merupakan skrining awal untuk senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antikanker. Hasil uji toksisitas dengan metoda BSLT dapat diketahui dari jumlah kematian larva udang Artemia salina Leach karena pengaruh ekstrak atau senyawa tertentu dari dosis yang telah ditentukan.

Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsip uji toksisitas adalah bahwa komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya sehingga banyak digunakan dalam uji toksisitas. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungan akan terserap ke dalam tubuh secara difusi dan langsung memengaruhi kehidupannya. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing tersebut bersifat toksik. Uji toksisitas digunakan untuk mengetahui pengaruh racun yang dihasilkan oleh dosis tunggal dari suatu campuran zat kimia.

Salah satu metode untuk menguji bahan-bahan yang bersifat sitotoksik adalah dengan uji toksisitas terhadap larva udang dari Artemia Salina Leach (Brine Shrimp Lethality Test). Metode ini sering digunakan untuk praskrining terhadap senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak perlu kondisi aseptis) dan dapat dipercaya.

Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) merupakan suatu metoda yang digunakan untuk menguji bahan-bahan yang bersifat toksik. Toksisitas didefinisikan sebagai kemampuan suatu zat yang memiliki sifat destruktif pada sel terutama yang menyangkut proses suatu sel dalam sistem kekebalan tubuh.

B. Rumusan Masalah
Rumusan masalah yang terdapat dalam percobaan ini yaitu bagaimana cara menentukan nilai toksisitas ekstrak menggunakan metode BSLT?

C. Tujuan 
Tujuan dari percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara menentukan nilai toksisitas ekstrak menggunakan metode BSLT

D. Manfaat
Manfaat dari percobaan ini yaitu mampu memberikan informasi cara menentukan nilai toksisitas ekstrak menggunakan metode BSLT

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Salah satu metode awal untuk uji sitotoksik adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. Metode BSLT telah terbukti memiliki korelasi dengan aktivitas antikanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat, dan cukup akurat, Uji toksisitas dilakukan dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach yang berumur 48 jam. Efek toksik ekstrak diidentifikasi dengan presentase kematian larva udang menggunakan analisis probit (LC50) (Muaja A. D., dkk., 2013).

Pengujian toksisitas diakukan dengan menggunakan metode BSLT (brine shrimp lethality test) dengan larva udang Artemia salina Leach. Metode BSLT dipilih dengan berbagai alasan. Alasan petama, metode ini merupakan metode penapisan farmakologi awal yang mudah dan relatife tidak mahal. Kedua, metode ini merupakan metode yang telah teruji hasilnya dngan tingkat kepercayaan 95% untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak kasar dan yang keempat metode ini sering dikaitkan sebagai metode penapisan untuk penyarian senyawa antikanker dari tanaman. Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungannya akan terserap kedalam tubuh dengan cara difusi dan langsung mempengaruhi kehidupan larva udag tersebut. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing tersebut bersifat toksik (Devi Anggraeni S dan Erwin., 2015).

Metode uji toksisitas dapat dilakukan secara in vitro maupun in vivo. Salah satu metode toksisitas in vitro yang sering digunakan adalah metode Brine Shrimp Letality Test (BSLT). Metode BSLT merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk skrining toksisitas dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach. Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spektrum aktivitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat dipercaya. Di samping itu, metode ini sering dikaitkan dengan metode penapisan senyawa antikanker (Frengki, 2014).

Penetasan telur Artemia salina Lench dapat dilakukan dengan menggunakan air laut buatan yang dilengkapi dengan aerator dan lampu. Air laut yang digunakan harus memiliki kisaran pH 8-9 karena penetasan tidak akan terjadi jika pH kurang dari 7. Pada pH 8-9, enzim penetas mempunyai aktivitas optimum sehingga terjadi proses pecahnya lapisan tipis pada telur. Penyinaran saat proses penetasan berfungsi untuk menghangatkan suhu air tersebut. Selain itu, adanya cahaya dapat merangsang pengaktifan kembali perkembangan embrio Artemia salina. Aerator harus selalu dinyalakan selama proses penetasan agar selalu terpenuhinya kebutuhan akan oksigen dan mencegah terjadinya pengendapan kista-kista di dasar wadah penetasan. Pengendapan kista-kista dapat menimbulkan kondisi anaerob sehingga perkembangan embrio menjadi terhambat (Retno Prasetia dan iis intan w, 2013)

Salah satu metode awal yang sering dipakai untult mengamati toksisitas senyawa dan inerupakan metode penapisan untuk aktivitas antikanker senyawa kimia dalam ekstrak tanaman adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), dengan menggunakan cara Meyer. Metode ini ditujukan terhadap tingltat mortalitas larva udang Artemia salina L. yang disebabkan oleh ekstrak uji. Hasil yang diperoleh dihitung sebagai nilai LC50 (Letal concentration) ekstrak uji, yaitu jumlah dosis atau konsentrasi ekstrak uji yang dapat menyebabkan kematian larva udang sejumlah 50% setelah masa inkubasi 24 jam (Lisdawati V., dkk., 2006).

BAB III 
METODE KERJA
A. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum’at, tanggal 30 Desember 2016, Pukul 08.00-11.30 WITA. Bertempat di Laboratorium Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Halu Oleo, Kendari.

B. Alat dan Bahan
1. Alat 
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Botol vial
  • Batang pengaduk
  • Gelas kimia 100 ml, 500 ml
  • Gelas ukur 50 ml, 100 ml, 250 ml
  • Labu takar 50 ml, 100 ml
  • Pipet tetes
  • Spatula 
  • Timbangan analitik

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Air laut
  • Aquades
  • Ekstrak jarak merah
  • Etanol
  • Larva udang
  • Tissue

C. Uraian Bahan
1. Aquades (Ditjen POM, 1979 : 96)
Nama Resmi : Aqua Destillata
Nama Lain : Aquades, Air Suling 
Rumus Molekul : H2O
Gambar Struktur :
Berat Molekul : 18,02 g/mol
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak mempunyai rasa
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup 
Kegunaan : Pelarut

2. Etanol (Ditjen POM, 1979 : 65) 
Nama Resmi : Aethanolum
Nama Lain : Alkohol, etanol
Rumus Molekul : C2H5OH
Berat Molekul : 46,07 g/mol
Gambar Struktru : 
Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap dan mudah bergerak, bau khas, rasa panas. Mudah terbakar dengan memberikan nyala biru yang tidak berasap. 
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, dalam kloroform P, dan dalam eter P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, ditempat sejuk, jauh dari nyala api
Kegunaan : Antiseptik

D. Uraian Hewan Coba
1. Klasifikasi Larva Udang (Mudjiman, 1998)
Filum : Arthopoda
Divisio : Crustaceae
Subdivisio : Branchiopoda 
Ordo : Anostraca
Famili : Artemiidae
Genus : Artemia
Species : Artemia salina

2. Morfologi (Mudjiman, 1998)
Udang (Artemia salina) mengalami beberapa fase hidup, tetapi secara jelas dapat dilihat dalam tiga bentuk yang sangat berlainan, yaitu bentuk telur, larva (nauplii) dan artemia dewasa. Telur yang baru dipanen dari alam berbentuk bulat dengan ukuran 0,2-0,3 mm. Telur yang menetas akan berubah menjadi larva. Telur yang baru menetas ini berukuran kurang lebih 300 µ. Dalam pertumbuhannya larva mengalami 15 kali perubahan bentuk yang merupakan satu tingkatan hidup, setelah itu berubah menjadi artemia dewasa.

Waktu yang diperlukan sampai menjadi artemia dewasa umumnya sekitar 2 minggu. Berbentuk silinder dengan panjang 12-15 mm. Tubuh terbagi atasl bagian kepala, dada dan perut. Pada bagian kepala terdapat 2 tangkai mata, 2 antena dan dua antenula. Dada terbagi atas 12 segmen yang masing-masing mempunyai sepasang kaki renang. Perut ternagi atas 8 segmen. Dapat hidup dalam air dengan suhu 25o-30oC dan pH sekitar 8-9. 

3. Uraian Tentang Larva (Mudjiman, 1998)
Telur-telur yang kering direndam dalam air laut yang bersuhu 25oC akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Burayak tingkat I dinamakan instar, tingkat II instar II, tingkat III Instar III, demikian seterusnya sampai Instar XV. Setelah itu berubahlah mereka menjadi artemia dewasa.

Burayak yang baru saja menetas masih dalam tingkat Instar I bentuknya bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron (0,4 mm) dan beratnya 15 mikrogram. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu, mereka masih belum perlu makanan.

Anggota badannya terdiri dari sungut kecil (antenula atau antena I dan sepasang sungut besar (antenna II). Dibagian depan diantara kedua sungut kecilnya terdapat bintik merah yang tidak lain adalah mata naupliusnya (oselus). Dibelakang sungut besar terdapat sepasang mandibula (rahang) dan rudimenter kecil. Sedangkan dibagian perur (ventral) sebelah depan terdapatlah labrum.

Pada pangkal sungut besar (antena II) terdapat bangunan seperti duri yang menghadap ke belakang (gnotobasen seta) bangunan ini merupakan cirri khusus untuk membedakan burayak instar I, instar II dan instar III. Pada burayak instar I (baru menetas) gnotobasen setanya masih belum berbulu dan juga belum bercabang. 

Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II. Lebih lama lagi akan berubah menjadi instar III.Pada tingkatan II, gnotobasen setanya sudah berbulu tapi masih belum bercabang. Sedangkan pada instar III, selain berbulu gnotobasen seta tersebut sudah bercabang II.

Pada tingkatan instar II, burayak mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari makan, bersamaan dengan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya dengan cara menggerak-gerakkan antena II-nya. Selain itu untuk mengumpulkan makanan antena II juga berfungsi untuk bergerak. Tubuh instar II dan instar III sudah lebih panjang dari instar I.

Pada tingkatan selanjutnya, disebelah kanan dan kiri mata nauplius mulai terbentuk sepasang mata majemuk. Mula-mula masih belum bertangkai. Kemudian secara berangsur-angsur berubah menjadi bertangkai. Selain itu, dibagian samping badannya (kanan dan kiri) juga berangsur-angsur tumbuh tunas kakinya (torakopada). Mula-mula tumbuh dibagian depan kemudian berturut-turut disusul oleh bagian-bagian yang lebih ke belakang. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah masa burayak, dan berubah menjadi artemia dewasa.

E. Uraian Tanaman 
1. Klasifikasi Jarak Merah (Jatropha gossypifolia) (Hossain, 2008).
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae
Ordo : Euphobiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Jatropha
Spesies : Jatropha gossypifolia L. 

2. Morfologi Tanaman
Jatropha gossypifolia (Linn) merupakantumbuhan semak yang tegak atau pohon kecil, biasanya tinggi sekitar 2,5 m tetapi yang dapat melebihi 4 m di beberapa daerah. Beberapa spesimen memiliki satu batang, sedangkan yang lain dapat memiliki dua atau lebih batang. Batang yang tebal, agak lunak, kasar, berbulu, panjang 1-2 m danmemiliki getah berair ketika luka. Batang kenaikan dari mahkota herba. Daun yang belum matang akan berwarna ungu dan lengket, daun yang lebih tua umumnya hijau mengkilap meskipun beberapa mungkin memiliki pewarnaan ungu. Bunga-bunga berwarna ungu / merah dengan pusat kuning dan diproduksi dalam kelompok pada percabangan batang di axils daun bagian atas. Buah berbentuk kapsul (biji polong) adalah sub-globular (bulat agak lonjong), panjang sekitar 12 mm dan lebar 10 mm.

F. Prosedur Kerja
LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH (JATROPHA GOSSYPIFOLIA) METODE  BRINE SHIRMP LETHALITY (BSLT) SECARA BIOASSAY

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan
1. Tabel Pengamatan
LAPORAN UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK METANOL JARAK MERAH (JATROPHA GOSSYPIFOLIA) METODE  BRINE SHIRMP LETHALITY (BSLT) SECARA BIOASSAY


B. Pembahasan
Bioassay adalah penggunakan organism uji untuk mengukur infektifitas relative patogen atau toksisitas zat. Kanamicin merupakan antibiotik golongan aminoglikosida yang bekerja menghambat proses sintesis protein mikroorganisme.

Toksikologi adalah ilmu yang menetapkan batas aman dari bahan kimia. Selain itu toksikologi juga mempelajari jelas/kerusakan/ cedera pada organisme (hewan, tumbuhan, manusia) yang diakibatkan oleh suatu materi substansi/energi, mempelajari racun, tidak saja efeknya, tetapi juga mekanisme terjadinya efek tersebut pada organisme dan mempelajari kerja kimia yang merugikan terhadap organisme.

Uji toksisitas merupakan pengujian yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan efek umum suatu senyawa pada hewan coba. Tipe uji toksisitas terbagi menjadi dua, yaitu uji tokisitas umum dan uji toksisitas khusus. Uji toksisitas umum terbagi lagi menjadi tiga, yaitu uji toksisitas akut, uji toksisitas jangka pendek (subakut/subkronik), dan uji toksisitas jangka panjang. Sedangkan uji toksisitas khusus mencakup uji karsinogenesis, mutagenesis, teratogenesis, dan imunotoksikologi.
Jarak pagar (Jatropha curcas L) merupakan salah satu tanaman yang dimanfaatkan untuk mengobati berbagai penyakit, salah satunya adalah penyakit kanker. Daun jarak pagar mengandung senyawa metabolit sekunder berupa flavonoid, saponin, tannin, polifenol, triterpenoid, steroid, dan glikosida, sehingga perlu dilakukan uji toksisitas pendahuluan dan uji antioksidan untuk mengetahui potensinya sebagai antikanker. 

Brine Shirmp Lethality Test (BSLT) merupakan uji pendahuluan yang mengarah pada uji sitotoksik senyawa metabolit sekunder dengan menggunakan larva udang Artemia salinaLeach sebagai hewan uji yang bertujuan untuk menguji ekstrak tumbuhan yang memiliki sifat toksik. Korelasinya adalah jika mortalitas terhadap A. salinaLeach yang ditimbulkan memiliki harga LC50 ˂ 1000 μg/mL. Beberapa kelebihan dari Brine ShirmpLethality Test (BSLT) ini adalah mudah dan relatif tidak mahal serta tidak membutuhkan suatu spesialisasi tertentu dalam pelaksanaannya. Metode ini juga merupakan metode yang telah teruji hasilnya dengan tingkat kepercayaan 95% untuk mengamati toksisitas suatu senyawa di dalam ekstrak tanaman.

Lethal Concentration 50 (LC50) yaitu konsentrasi yang menyebabkan kematian sebanyak 50% dari organisme uji ayang dapat diestimasi dengan grafik dan perhitungan, pada suatu waktu pengamatan tertentu, misalnya LC50 48 jam, LC50 96 jam, sampai waktu hidup hewan uji. Lethal Concentration 50 atau biasa disingkat LC50 adalah suatu perhitungan untuk menentukan keaktifan dari suatu ekstrak atau senyawa. Makna LC50 adalah pada konsentrasi berapa ekstrak dapat mematikan 50 % dari organisme uji, misalnya larva Artemia salina (brine shrimp).

Penentuan konsentrasi yang berbeda merupakan langkah dengan menyiapkan konsentrasi dari masing-masing sampel yaitu konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml untuk membandingkan toksisitas dan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut. Juga untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang mengalami LC50. air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan bukan dari laut. digunakan karena tanaman tersebut memiliki khasiat sebagai obat antikanker, dan alasan digunakannya larva udang dalam percobaan ini adalah karena larva udang merupakan general biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk melalui dinding sel larva tersebut. Pra perlakuan merupakan langkah pertama yakni menyiapkan larva udangnya. Pertama-tama Kista udang Artemia Salina leach dimasukkan kedalam wadah penetasan yang berisi air laut dan telah dilengkapi dengan aerator dan lampu. Biarkan 48 jam hingga menjadi larva. Setelah itu membuat larutan sampel dengan masing-masing konsentrasi. Hal pertama yang dilakukan adalah Sampel Jarak merah (Jatropha gossypifolia) 0,5 g dilarutkan dalam 500 ml aquades (larutan induk 1000 μg/ml) kemudian diencerkan untuk dibuat beberapa konsentrasi (4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm). Setelah itu, dimasukkan ke dalam botol vial dan keringkan. Lalu, dipipet 10 ml air laut di botol vial, dimasukkan 10 ekor larva Artemia Salina L, dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan dihitung nilai LC50. 

Diperoleh jumlah larva yang mati dari hasil rata – rata botol I, botol II, dan botol III masing-masing yaitu 8, 7, 7, 6, 5, 5, 4, 3, 3, dan 3 dengan nilai mortalitas 80 %, 70 %, 70 %. 60 %, 50 %, 50 %, 40 %, 30 %, 30 %, dan 30 %. Setelah didapat log konsentrasi diperoleh persaman regresi yaitu y= 0,011x + 41,53. Dengan perolehan nilai LC50 adalah 4,3 x 1014 μg/ml. Artinya konsentrasi larutan sampel yang menyebabkan kematian dengan nilai LC50 adalah konsentarsi 4,3 x 1014 μg/ml. Angka kematian hewan coba dihitung sebagai Median Lethal Dose (LD50) atau Median Lathal Concentration (LC50). Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan coba secara inhalasi atau menggunakan media air. Kematian pada hewan percobaan digunakan sebagai pedoman untuk memperkirakan dosis kematian pada manusia.
Uji Toksisitas Akut merupakan bagian dari Uji Toksisitas Kuantitatif yang dilakukan dalam jangka waktu yang singkat sebagai akibat dari pemaparan jangka pendek terhadap suatu bahan. Efek akut dapat terjadi dalam selang waktu beberapa jam, hari atau minggu. Hal ini yang membuat uji toksisitas ini tergolong uji toksisitas akut.

Plot probabilitas adalah teknik grafis untuk membandingkan dua set data, baik dua set pengamatan empiris, satu set empiris terhadap seperangkat teori, atau (lebih jarang) dua set teoritis terhadap satu sama lain. Sedangkan, Mortalitas adalah jumlah individu dalam populasi yang mati selama periode waktu tertentu. 

BAB V
PENUTUP
A. kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan disimpulkan bahwa dari beberapa konsentrasi yang telah di buat konsentrasi untuk mematikan 50% larva udang (Artemia salina) yaitu pada konsentrasi 250 dan 125 ppm. Sehingga ekstrak kulit batang jarak pagar (Jatropa gosyypholia L.) bersifat toksik dan memungkinkan penggunaannya dalam keamanan sediaan farmasi atau bahan alam dengan nilai LC50 dari ekstrak kulit batang jarak pagar (Jatropa gosyypholia L.) adalah 129 mg/L.

B. Saran
Sebaiknya dalam pengerjaan sampel maupun pengujian dilakukan lebih aseptis lagi dan lebih teliti lagi untuk mendapatkan hasil pengujian yang lebih baik, serta kelengkapan alat praktikum sebagai penunjang pada pengujian ini sebaiknya dilengkapi agar waktu pengujian tidak tertunda. 

DAFTAR PUSTAKA
Anggraeni D. S. dan Erwin., 2015, Uji Fitokimia dan Uji Toksisitas (Brine Shrimp Lethality Test) Ekstrak Daun Kelakai (Stenochlaena palustris), Program Studi Kimia FMIPA Universitas Mulawarman, samarinda, Indonesia.

Ditjen POM, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Ditjen POM, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Frengki, Roslizawaty, dan Desi Pertiwi., 2014, Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Sarang Semut Lokal Aceh (Mymercodia Sp.) Dengan Metode Bslt Terhadap Larva Udang Artemia Salina Leach, Jurnal Medika Veterinaria, Vol. 8 No. 1.

Lisdawati V. S., Umali Wiryowida Vol. 8 No. 1. gdo, dan L.Broto S. kardon., 2006, Brine Shrimp Lethality Test (Bslt) Dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah Dan Kulit Biji Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa), jurnal Bul. Penel. Kesehatan, Vol. 34, No. 3.

Muaja A. D., Harry S. J. Koleangan., dan Max R. J. Runtuwene., 2013, Uji Toksisitas dengan Metode BSLT dan Analisis Kandungan Fitokimia Ekstrak Daun Soyogik (Saurauia bracteosa DC) dengan Metode Soxhletasi, Jurnalmipa Unsrat Online 2(2).

Mudjiman, A., 1998, Udang Renik Air Asin, Bhrata Karya Aksara, Jakarta.

Prasetia R., dan Iis intan W., 2013, Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol Buah Lakum (Cayratia Tryfolia) Terhadap Larva Artemia Salina Leach Dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT).