LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY - ElrinAlria
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY
BAB I
PENDAHULUAN
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY
A. Latar Belakang
Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsip uji toksisitas adalah bahwa komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya sehingga banyak digunakan dalam uji toksisitas. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungan akan terserap ke dalam tubuh secara difusi dan langsung memengaruhi kehidupannya. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing tersebut bersifat toksik. 

Uji toksisitas digunakan untuk mengetahui pengaruh racun yang dihasilkan oleh dosis tunggal dari suatu campuran zat kimia pada hewan coba sebagai uji pra skrining senyawa bioaktif antikanker Salah satu metode yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas anti kanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. 

Penelitian ini menerapkan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan menggunakan larva udang Artemia salina leach sebagai hewan uji. Metode ini merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa anti kanker baru yang berasal dari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat. Bentuk ekstrak dipilih dengan harapan akan didapatkan kandungan senyawa aktif yang ada dalam tanaman batang jatropha. 

B. Rumusan Masalah
  1. Bagaimana prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam ?
  2. Bagaimana melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ?

C. Tujuan
  1. Untuk mengetahui prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam.
  2. Untuk melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Standarisasi obat berarti konfirmasi identitas dan penentuan kualitas dan kemurnian. Saat ini karena kemajuan dalam pengetahuan kimia simplisia berbagai metode seperti botani, kimia, spektroskopi dan metode biologi yang digunakan untuk memperkirakan konstituen aktif hadir dalam simplisia selain konstanta fisik. Ekstraksi dari konstituen tanaman bioaktif selalu menjadi tugas yang menantang bagi para peneliti. Dalam review sekarang ini, upaya telah dilakukan untuk memberikan gambaran dari ekstraktan tertentu dan proses ekstraksi dengan kelebihan dan kekurangan. Metode ekstraksi yang digunakan farmasi melibatkan pemisahan bagian aktif medicinally jaringan tanaman dari tidak aktif / komponen yang inert dengan menggunakan pelarut selektif. Selama ekstraksi, pelarut berdifusi ke dalam bahan tanaman dan melarutkan senyawa padat dengan polaritas yang sama. Produk tanaman Phytopharmaceutical dan sekunder obat pentingnya seperti alkaloid, glikosida, terpenoid, Flavonoid dan lignin (Pandey, 2014)

Ekstrak tumbuhan obat yang dibuat dari tanaman obat dapat dipandang sebagai bahan antara atau suatu produk jadi. Ekstrak sendiri dalam produk kefarmasian selain harus memenuhi persyaratan monografi bahan baku simplisia juga parameter-parameter standar umum dan spesifik (Isnawati, 2004). 

Sebuah bioassay umum yang muncul mampu mendeteksi spektrum dewan bioaktivitas hadir dalam ekstrak mentah adalah the brine shrimp lethality bioassay (BSLT). Teknik ini mudah dikuasai, biaya sedikit, dan menggunakan sejumlah kecil bahan uji. Tujuan dari metode ini adalah untuk memberikan layar lini depan yang dapat didukung oleh bioassay lebih spesifik dan lebih mahal sekali senyawa aktif telah diisolasi. Tampaknya BSLT adalah prediksi sitotoksisitas dan aktivitas pestisida . Sejak diperkenalkan pada tahun 1982, uji in vivo lethality ini telah berturut-turut digunakan untuk bioassay-panduan fraksinasi sitotoksik dan antitumor agen aktif seperti trilobatin dari kulit Asimina triloba, cis-annonacin dari sirsak dan asam ent-kaur-16-en-19-OIC dari Melanoselinum foetidum (Pisutthanan, 2004). 

Assay sitotoksik didasarkan pada evaluasi karakteristik langka kebanyakan agen sitotoksik, biasanya obat, hormon, nutrisi dan iradiasi. Tes sitotoksik telah digunakan untuk mengukur jumlah kematian akibat pengobatan dengan senyawa yang dapat menyebabkan kanker (Arullappan, 2013). 

Potensi toksisitas zat-zat kimia sering disajikan sebagai LC50. LC50 adalah konsentrasi zat yang mematikan untuk 50% dari organisme dalam uji toksisitas. LC50 dapat ditentukan untuk setiap waktu pemaparan, tetapi periode paparan yang paling umum adalah 96 jam. Jangka waktu umum lainnya adalah 24, 48, dan 72 jam. Sebagai aturan umum, semakin lama paparan, semakin rendah LC50 tersebut. Jika paparan cukup lama, nilai LC50 asymptotic dapat diperoleh. LC50 asymptotic tidak tergantung waktu (Boyd, 2005). 

LD50 adalah singkatan untuk "Lethal Dose 50%", kadang-kadang juga disebut sebagai "Median Lethal Dose". Meskipun LD50 tidak lagi ukuran lebih disukai untuk menilai toksisitas akut dosis tunggal suatu zat, untuk alasan historis itu mungkin masih ukuran yang paling sering dikutip. LD50 untuk zat tertentu pada dasarnya adalah jumlah yang dapat diharapkan untuk menyebabkan kematian pada setengah (yaitu 50%) dari kelompok spesies hewan tertentu, biasanya tikus atau tikus, ketika memasuki tubuh hewan dengan rute tertentu. Sebagai contoh, jika substansi yang tertelan, angka tersebut merupakan 'LD50' sedangkan jika itu diserap melalui kulit, itu adalah 'kulit LD50'. Angka LD50 yang diperoleh perhitungan matematis dari hasil tes pada hewan dan karenanya tidak dapat dianggap sebagai nilai-nilai biologis yang tepat. Secara umum, jumlah zat yang dibutuhkan untuk membunuh binatang dari spesies yang berbeda sekitar terkait dengan bobot tubuh hewan. Oleh karena itu, angka LD50 biasanya dilaporkan dalam satuan miligram zat per kilogram berat badan untuk spesies hewan yang bersangkutan (Wrightson, 2007). 

BAB III 
METODE KERJA
A. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum’at, tanggal 30 Desember 2016, Pukul 08.00-11.30 WITA. Bertempat di Laboratorium Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Halu Oleo, Kendari.

B. Alat dan Bahan
1. Alat 
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Botol vial
  • Batang pengaduk
  • Gelas kimia 100 ml, 500 ml
  • Gelas ukur 50 ml, 100 ml, 250 ml
  • Labu takar 50 ml, 100 ml
  • Pipet tetes
  • Spatula 
  • Timbangan analitik

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Air laut
  • Aquades
  • Ekstrak jarak merah
  • Etanol
  • Larva udang
  • Tissue

C. Uraian Bahan
1. Aquades (Ditjen POM, 1979 : 96)
Nama Resmi : Aqua Destillata
Nama Lain : Aquades, Air Suling 
Rumus Molekul : H2O
Gambar Struktur :
Berat Molekul : 18,02
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak mempunyai rasa
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup 
Kegunaan : Pelarut

2. Etanol (Ditjen POM, 1979 : 65) 
Nama Resmi : Aethanolum
Nama Lain : Alkohol, etanol
Rumus Molekul : C2H5OH
Berat Molekul : 46,07
Gambar Struktru : 
Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap dan mudah bergerak, bau khas, rasa panas. Mudah terbakar dengan memberikan nyala biru yang tidak berasap. 
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, dalam kloroform P, dan dalam eter P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, ditempat sejuk, jauh dari nyala api
Kegunaan : Antiseptik

D. Uraian Hewan Coba
1. Klasifikasi Larva Udang (Mudjiman, 1998)
Filum : Arthopoda
Divisio : Crustaceae
Subdivisio : Branchiopoda
Ordo : Anostraca
Famili : Artemiidae
Genus : Artemia
Species : Artemia salina

2. Morfologi (Mudjiman, 1998) 
Udang (Artemia salina) mengalami beberapa fase hidup, tetapi secara jelas dapat dilihat dalam tiga bentuk yang sangat berlainan, yaitu bentuk telur, larva (nauplii) dan artemia dewasa. Telur yang baru dipanen dari alam berbentuk bulat dengan ukuran 0,2-0,3 mm. Telur yang menetas akan berubah menjadi larva. Telur yang baru menetas ini berukuran kurang lebih 300 µ. Dalam pertumbuhannya larva mengalami 15 kali perubahan bentuk yang merupakan satu tingkatan hidup, setelah itu berubah menjadi artemia dewasa.

Waktu yang diperlukan sampai menjadi artemia dewasa umumnya sekitar 2 minggu. Berbentuk silinder dengan panjang 12-15 mm. Tubuh terbagi atasl bagian kepala, dada dan perut. Pada bagian kepala terdapat 2 tangkai mata, 2 antena dan dua antenula. Dada terbagi atas 12 segmen yang masing-masing mempunyai sepasang kaki renang. Perut ternagi atas 8 segmen. Dapat hidup dalam air dengan suhu 25o-30oC dan pH sekitar 8-9. 

3. Uraian Tentang Larva (Mudjiman, 1998)
Telur-telur yang kering direndam dalam air laut yang bersuhu 25oC akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Burayak tingkat I dinamakan instar, tingkat II instar II, tingkat III Instar III, demikian seterusnya sampai Instar XV. Setelah itu berubahlah mereka menjadi artemia dewasa.

Burayak yang baru saja menetas masih dalam tingkat Instar I bentuknya bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron (0,4 mm) dan beratnya 15 mikrogram. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu, mereka masih belum perlu makanan.

Anggota badannya terdiri dari sungut kecil (antenula atau antena I dan sepasang sungut besar (antenna II). Dibagian depan diantara kedua sungut kecilnya terdapat bintik merah yang tidak lain adalah mata naupliusnya (oselus). Dibelakang sungut besar terdapat sepasang mandibula (rahang) dan rudimenter kecil. Sedangkan dibagian perur (ventral) sebelah depan terdapatlah labrum.

Pada pangkal sungut besar (antena II) terdapat bangunan seperti duri yang menghadap ke belakang (gnotobasen seta) bangunan ini merupakan cirri khusus untuk membedakan burayak instar I, instar II dan instar III. Pada burayak instar I (baru menetas) gnotobasen setanya masih belum berbulu dan juga belum bercabang. 

Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II. Lebih lama lagi akan berubah menjadi instar III.Pada tingkatan II, gnotobasen setanya sudah berbulu tapi masih belum bercabang. Sedangkan pada instar III, selain berbulu gnotobasen seta tersebut sudah bercabang II.

Pada tingkatan instar II, burayak mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari makan, bersamaan dengan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya dengan cara menggerak-gerakkan antena II-nya. Selain itu untuk mengumpulkan makanan antena II juga berfungsi untuk bergerak. Tubuh instar II dan instar III sudah lebih panjang dari instar I.

Pada tingkatan selanjutnya, disebelah kanan dan kiri mata nauplius mulai terbentuk sepasang mata majemuk. Mula-mula masih belum bertangkai. Kemudian secara berangsur-angsur berubah menjadi bertangkai. Selain itu, dibagian samping badannya (kanan dan kiri) juga berangsur-angsur tumbuh tunas kakinya (torakopada). Mula-mula tumbuh dibagian depan kemudian berturut-turut disusul oleh bagian-bagian yang lebih ke belakang. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah masa burayak, dan berubah menjadi artemia dewasa.

E. Uraian Tanaman 
1. Klasifikasi Jarak Merah (Jatropha gossypifolia)
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae
Ordo : Euphobiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Jatropha
Spesies : Jatropha gossypifolia L.

2. Morfologi Tanaman
Jarak merah (Jatropha gossypifolia) tergolong kedalam kelompok tanaman berdaun tidak lengkap. Hal ini karena pada bagian daunnya hanya memiliki petiolus (tangkai daun) dan lamina (helaian daun), tanpa memiliki pelepah daun. Circumscriptio atau bangun daunnya berbentuk orbicularis (bulat). Dikatakan memiliki bangun daun berbentuk orbicularis karena pada perbandingan panjang dan lebar, jarak merah yaitu 1 : 1. Memiliki intervenium (daging daun) yaitu tipis lunak (herbaceus). Pada bagian margo folii, daunnya bergerigi (serratus). Pada bagian apex folii, daunnya meruncing (acuminatus). Karena pada titik pertemuan kedua tepi daunnya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan ujung daun yang berbentuk runcing (acutus), dan ujung daun nampak sempit memanjang dan runcing. 

Bagian basis foliinya berlekuk (emarginatus), hal ini ditemukan pada daun-daun bangun jantung, ginjal, dan anak panah. Permukaan daunnya yaitu gundul (gleber). Susunan tulang-tulang daun (nervatio) dari jarak merah adalah menjari (palminervis). Dikatakan menjari, karena dari ujung tangkai daun keluar beberapa tulang yang memencar, memperlihatkan susunan jari-jari seperti tangan

F. Prosedur Kerja
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN


A. Hasil Pengamatan
1. Tabel Pengamatan
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY

B. Pembahasan
Bioassay adalah suatu test atau uji yang menggunakan organisme hidup untuk mengetahui efektifitas suatu bahan hidup ataupun bahan organik dan anorganik terhadap suatu organisme hidup. Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi, oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian.

Toksikologi adalah pengetahuan tentang efek racun dari obat terhadap tubuh dan sebetulnya termasuk pula dalam kelompok farmakodinamika, karena efek terapeutis obat berhubungan erat dengan efek toksisnya. Pada hakikatnya setiap obat dalam dosis yang cukup tinggi dapat bekerja sebagai racun dan merusak organisme (“Sola dosis facit venenum”: hanya dosis membuat racun, Paracelsus). 

Pohon jarak merah yang disebut (Jatropha gossypifolia L) dalam bahasa latin merupakan tanaman jenis etobotani yang dapat juga digunakan sebagai sumber obat tradisional, beberapa manfaat banyak terdapat pada setiap jaringan tanaman ini. Misalnya bijinya dapat digunakan sebagai obat pencahar, namaun dari beberapa informasi yang ada sekarang penggunaan biji tanaman ini sebagai obat herbal sangat dilarang karena terdapat kandungan toksiksitasnya yang tinggi. Salah satu negara yang melarang penggunaan tanaman ini sebagai obat herbal yakni negara Thailand, biasanya tanaman ini juga digunakan sebagai etoveterinari oleh para pemburu untuk mengobati luka bekas gigitan ular, luka kudis pada anjing pemburu, dan juga mengobati bekas sengatan kalajengking. Jarak merah (Jatropha gossypifolia) tergolong kedalam kelompok tanaman berdaun tidak lengkap. Hal ini karena pada bagian daunnya hanya memiliki petiolus (tangkai daun) dan lamina (helaian daun), tanpa memiliki pelepah daun.

Salah satu metode yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine shrimp lethality test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas anti kanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Penelitian ini menerapkan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) dengan menggunakan larva udang Artemia salina leach sebagai hewan uji. Metode ini merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa anti kanker baru yang berasal dari tanaman. Artemia salina Leach adalah udang tingkat rendah yang hidup sebagai zooplankton. Artemia pada tahun 1778 diberi nama cancer salinus,yang kemudian diubah menjadi Artemia salina pada tahun 1819 oleh Leach.

Artemia sebelumnya telah digunakan dalam bermacam-macam uji hayati seperti uji pestisida, polutan, mikotoksin, anestetik, komponen seperti morfin, kekarsinogenikan dan toksikan dalam air laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan Artemia salina memiliki beberapa keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana.

LC50 adalah konsentrasi dari suatu senyawa kimia di udara atau dalam air yang dapat menyebabkan 50% kematian pada suatu populasi hewan uji atau makhluk hidup tertentu. Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan uji secara berkelompok yaitu pada saat hewan uji dipaparkan suatu bahan kimia melalui udara maka hewan uji tersebut akan menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air. Nilai LC50 dapat digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa sehingga dapat juga untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker.

Penentuan konsentrasi yang berbeda merupakan langkah dengan menyiapkan konsentrasi dari masing-masing sampel yaitu konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml untuk membandingkan toksisitas dan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut. Juga untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang mengalami LC50. air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan bukan dari laut. digunakan karena tanaman tersebut memiliki khasiat sebagai obat antikanker, dan alasan digunakannya larva udang dalam percobaan ini adalah karena larva udang merupakan general biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk melalui dinding sel larva tersebut.Pra perlakuan merupakan langkah pertama yakni menyiapkan larva udangnya. Pertama-tama Kista udang Artemia Salina leach dimasukkan kedalam wadah penetasan yang berisi air laut dan telah dilengkapi dengan aerasi dan lampu. Biarkan 48 jam hingga menjadi larva. Setelah itu membuat larutan sampel dengan masing-masing konsentrasi. Hal pertama yang dilakukan adalah Sampel Lada Hitam (Piper nigrum L.) 0,5 g dilarutkan dalam 500 ml aquades (larutan induk 1000 μg/ml) kemudian diencerkan untuk dibuat beberapa konsentrasi (4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm). Setelah itu, dimasukkan ke dalam botol vial dan keringkan. Lalu, dipipet 10 ml air laut di botol vial, dimasukkan 10 ekor larva Artemia Salina L, dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan dihitung nilai LC50. 

Pengujian diatas diperoleh hasil pada kelompok kami yaitu pada konsentrasi 4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm dan 12,5 ppm diperoleh jumlah larva yang mati dari hasil rata – rata botol I, botol II, dan botol III masing-masing yaitu 8, 7, 7, 6, 5, 5, 4, 3, 3, dan 3 dengan nilai mortalitas 80 %, 70 %, 70 %. 60 %, 50 %, 50 %, 40 %, 30 %, 30 %, dan 30 %. Setelah didapat log konsentrasi diperoleh persaman regresi yaitu y= 0,011x + 41,53. Dengan perolehan nilai LC50 adalah 4,3 x 1014 μg/ml. Artinya konsentrasi larutan sampel yang menyebabkan kematian dengan nilai LC50 adalah konsentarsi 4,3 x 1014 μg/ml. Angka kematian hewan coba dihitung sebagai Median Lethal Dose (LD50) atau Median Lathal Concentration (LC50). Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan coba secara inhalasi atau menggunakan media air. Kematian pada hewan percobaan digunakan sebagai pedoman untuk memperkirakan dosis kematian pada manusia.

BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa ; 
  1. Prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam salah satunya adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 
  2. Uji Bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yaitu dengan melakukan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Prosedurnya dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salinaLeach. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC < 1000 μg/ ml.

DAFTAR PUSTAKA
Arullapan, S., Muhamad, S., dan Zakaria, Z., 2013, Cytotoxic Activity of the Leaf and Stem Extracts of Hibiscus rosa sinensis (Malvaceae) against Leukaemic Cell Line (K-562), Tropical Journal of Pharmaceutical, Vol. 5 (12). 

Boyd, Claude E., LC50 Calculations Help Predict Toxicity, Global Aquaculture Advocate, Auburn University. 

Goyal, R.K., 2008, Pharmacology Principles and Methods of Bioassay, College of Pharmacy, Navrangpura 

Isnawati, Ani, dkk., 2004, Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak Daun Strobilanthus Crispus, Jurnal Media Litbang Kesehatan, Vol. 14 (2) 

Mudjiman, A., 1998, Udang Renik Air Asin, Bhrata Karya Aksara, Jakarta.

Pandey, Amita, dan Tripathy, Shalini, 2014, Concept Of Standardization, Extraction And Pre Phytochemical Screening Strategies For Herbal Drug, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, Vol. 2 (5) 

Pisutthanan, S., dkk., 2004, Brine Shrimp Lethality Activity of Thai Medicinal Plants in the Family Meliaceae, Narefuan University Journal, Vol. 12 (2)

Rani, S. K. S., Saxena, N., Udaysree, 2013, Antimicrobial Activity of Black Pepper (Piper nigrum L.), Global Journal of Pharmacology, Vol. 7 (1)

Wrightson, 2007, “LD50” [LETHAL DOSE 50 %], Advancing the Chemical Sciences, Burlington house, London.

LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY

LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY
BAB I
PENDAHULUAN
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY
A. Latar Belakang
Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsip uji toksisitas adalah bahwa komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dengan dosis tinggi dan menjadi obat pada dosis rendah. Larva udang memiliki kulit yang tipis dan peka terhadap lingkungannya sehingga banyak digunakan dalam uji toksisitas. Zat atau senyawa asing yang ada di lingkungan akan terserap ke dalam tubuh secara difusi dan langsung memengaruhi kehidupannya. Larva udang yang sensitif ini akan mati apabila zat atau senyawa asing tersebut bersifat toksik. 

Uji toksisitas digunakan untuk mengetahui pengaruh racun yang dihasilkan oleh dosis tunggal dari suatu campuran zat kimia pada hewan coba sebagai uji pra skrining senyawa bioaktif antikanker Salah satu metode yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas anti kanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. 

Penelitian ini menerapkan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan menggunakan larva udang Artemia salina leach sebagai hewan uji. Metode ini merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa anti kanker baru yang berasal dari tanaman. Hasil uji toksisitas dengan metode ini telah terbukti memiliki korelasi dengan daya sitotoksis senyawa anti kanker. Selain itu, metode ini juga mudah dikerjakan, murah, cepat dan cukup akurat. Bentuk ekstrak dipilih dengan harapan akan didapatkan kandungan senyawa aktif yang ada dalam tanaman batang jatropha. 

B. Rumusan Masalah
  1. Bagaimana prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam ?
  2. Bagaimana melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) ?

C. Tujuan
  1. Untuk mengetahui prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam.
  2. Untuk melakukan uji bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Standarisasi obat berarti konfirmasi identitas dan penentuan kualitas dan kemurnian. Saat ini karena kemajuan dalam pengetahuan kimia simplisia berbagai metode seperti botani, kimia, spektroskopi dan metode biologi yang digunakan untuk memperkirakan konstituen aktif hadir dalam simplisia selain konstanta fisik. Ekstraksi dari konstituen tanaman bioaktif selalu menjadi tugas yang menantang bagi para peneliti. Dalam review sekarang ini, upaya telah dilakukan untuk memberikan gambaran dari ekstraktan tertentu dan proses ekstraksi dengan kelebihan dan kekurangan. Metode ekstraksi yang digunakan farmasi melibatkan pemisahan bagian aktif medicinally jaringan tanaman dari tidak aktif / komponen yang inert dengan menggunakan pelarut selektif. Selama ekstraksi, pelarut berdifusi ke dalam bahan tanaman dan melarutkan senyawa padat dengan polaritas yang sama. Produk tanaman Phytopharmaceutical dan sekunder obat pentingnya seperti alkaloid, glikosida, terpenoid, Flavonoid dan lignin (Pandey, 2014)

Ekstrak tumbuhan obat yang dibuat dari tanaman obat dapat dipandang sebagai bahan antara atau suatu produk jadi. Ekstrak sendiri dalam produk kefarmasian selain harus memenuhi persyaratan monografi bahan baku simplisia juga parameter-parameter standar umum dan spesifik (Isnawati, 2004). 

Sebuah bioassay umum yang muncul mampu mendeteksi spektrum dewan bioaktivitas hadir dalam ekstrak mentah adalah the brine shrimp lethality bioassay (BSLT). Teknik ini mudah dikuasai, biaya sedikit, dan menggunakan sejumlah kecil bahan uji. Tujuan dari metode ini adalah untuk memberikan layar lini depan yang dapat didukung oleh bioassay lebih spesifik dan lebih mahal sekali senyawa aktif telah diisolasi. Tampaknya BSLT adalah prediksi sitotoksisitas dan aktivitas pestisida . Sejak diperkenalkan pada tahun 1982, uji in vivo lethality ini telah berturut-turut digunakan untuk bioassay-panduan fraksinasi sitotoksik dan antitumor agen aktif seperti trilobatin dari kulit Asimina triloba, cis-annonacin dari sirsak dan asam ent-kaur-16-en-19-OIC dari Melanoselinum foetidum (Pisutthanan, 2004). 

Assay sitotoksik didasarkan pada evaluasi karakteristik langka kebanyakan agen sitotoksik, biasanya obat, hormon, nutrisi dan iradiasi. Tes sitotoksik telah digunakan untuk mengukur jumlah kematian akibat pengobatan dengan senyawa yang dapat menyebabkan kanker (Arullappan, 2013). 

Potensi toksisitas zat-zat kimia sering disajikan sebagai LC50. LC50 adalah konsentrasi zat yang mematikan untuk 50% dari organisme dalam uji toksisitas. LC50 dapat ditentukan untuk setiap waktu pemaparan, tetapi periode paparan yang paling umum adalah 96 jam. Jangka waktu umum lainnya adalah 24, 48, dan 72 jam. Sebagai aturan umum, semakin lama paparan, semakin rendah LC50 tersebut. Jika paparan cukup lama, nilai LC50 asymptotic dapat diperoleh. LC50 asymptotic tidak tergantung waktu (Boyd, 2005). 

LD50 adalah singkatan untuk "Lethal Dose 50%", kadang-kadang juga disebut sebagai "Median Lethal Dose". Meskipun LD50 tidak lagi ukuran lebih disukai untuk menilai toksisitas akut dosis tunggal suatu zat, untuk alasan historis itu mungkin masih ukuran yang paling sering dikutip. LD50 untuk zat tertentu pada dasarnya adalah jumlah yang dapat diharapkan untuk menyebabkan kematian pada setengah (yaitu 50%) dari kelompok spesies hewan tertentu, biasanya tikus atau tikus, ketika memasuki tubuh hewan dengan rute tertentu. Sebagai contoh, jika substansi yang tertelan, angka tersebut merupakan 'LD50' sedangkan jika itu diserap melalui kulit, itu adalah 'kulit LD50'. Angka LD50 yang diperoleh perhitungan matematis dari hasil tes pada hewan dan karenanya tidak dapat dianggap sebagai nilai-nilai biologis yang tepat. Secara umum, jumlah zat yang dibutuhkan untuk membunuh binatang dari spesies yang berbeda sekitar terkait dengan bobot tubuh hewan. Oleh karena itu, angka LD50 biasanya dilaporkan dalam satuan miligram zat per kilogram berat badan untuk spesies hewan yang bersangkutan (Wrightson, 2007). 

BAB III 
METODE KERJA
A. Waktu dan Tempat Praktikum
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Jum’at, tanggal 30 Desember 2016, Pukul 08.00-11.30 WITA. Bertempat di Laboratorium Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Halu Oleo, Kendari.

B. Alat dan Bahan
1. Alat 
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Botol vial
  • Batang pengaduk
  • Gelas kimia 100 ml, 500 ml
  • Gelas ukur 50 ml, 100 ml, 250 ml
  • Labu takar 50 ml, 100 ml
  • Pipet tetes
  • Spatula 
  • Timbangan analitik

2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah:
  • Air laut
  • Aquades
  • Ekstrak jarak merah
  • Etanol
  • Larva udang
  • Tissue

C. Uraian Bahan
1. Aquades (Ditjen POM, 1979 : 96)
Nama Resmi : Aqua Destillata
Nama Lain : Aquades, Air Suling 
Rumus Molekul : H2O
Gambar Struktur :
Berat Molekul : 18,02
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, tidak mempunyai rasa
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup 
Kegunaan : Pelarut

2. Etanol (Ditjen POM, 1979 : 65) 
Nama Resmi : Aethanolum
Nama Lain : Alkohol, etanol
Rumus Molekul : C2H5OH
Berat Molekul : 46,07
Gambar Struktru : 
Pemerian : Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap dan mudah bergerak, bau khas, rasa panas. Mudah terbakar dengan memberikan nyala biru yang tidak berasap. 
Kelarutan : Sangat mudah larut dalam air, dalam kloroform P, dan dalam eter P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, ditempat sejuk, jauh dari nyala api
Kegunaan : Antiseptik

D. Uraian Hewan Coba
1. Klasifikasi Larva Udang (Mudjiman, 1998)
Filum : Arthopoda
Divisio : Crustaceae
Subdivisio : Branchiopoda
Ordo : Anostraca
Famili : Artemiidae
Genus : Artemia
Species : Artemia salina

2. Morfologi (Mudjiman, 1998) 
Udang (Artemia salina) mengalami beberapa fase hidup, tetapi secara jelas dapat dilihat dalam tiga bentuk yang sangat berlainan, yaitu bentuk telur, larva (nauplii) dan artemia dewasa. Telur yang baru dipanen dari alam berbentuk bulat dengan ukuran 0,2-0,3 mm. Telur yang menetas akan berubah menjadi larva. Telur yang baru menetas ini berukuran kurang lebih 300 µ. Dalam pertumbuhannya larva mengalami 15 kali perubahan bentuk yang merupakan satu tingkatan hidup, setelah itu berubah menjadi artemia dewasa.

Waktu yang diperlukan sampai menjadi artemia dewasa umumnya sekitar 2 minggu. Berbentuk silinder dengan panjang 12-15 mm. Tubuh terbagi atasl bagian kepala, dada dan perut. Pada bagian kepala terdapat 2 tangkai mata, 2 antena dan dua antenula. Dada terbagi atas 12 segmen yang masing-masing mempunyai sepasang kaki renang. Perut ternagi atas 8 segmen. Dapat hidup dalam air dengan suhu 25o-30oC dan pH sekitar 8-9. 

3. Uraian Tentang Larva (Mudjiman, 1998)
Telur-telur yang kering direndam dalam air laut yang bersuhu 25oC akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak (larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya, burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis). Burayak tingkat I dinamakan instar, tingkat II instar II, tingkat III Instar III, demikian seterusnya sampai Instar XV. Setelah itu berubahlah mereka menjadi artemia dewasa.

Burayak yang baru saja menetas masih dalam tingkat Instar I bentuknya bulat lonjong dengan panjang sekitar 400 mikron (0,4 mm) dan beratnya 15 mikrogram. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu, mereka masih belum perlu makanan.

Anggota badannya terdiri dari sungut kecil (antenula atau antena I dan sepasang sungut besar (antenna II). Dibagian depan diantara kedua sungut kecilnya terdapat bintik merah yang tidak lain adalah mata naupliusnya (oselus). Dibelakang sungut besar terdapat sepasang mandibula (rahang) dan rudimenter kecil. Sedangkan dibagian perur (ventral) sebelah depan terdapatlah labrum.

Pada pangkal sungut besar (antena II) terdapat bangunan seperti duri yang menghadap ke belakang (gnotobasen seta) bangunan ini merupakan cirri khusus untuk membedakan burayak instar I, instar II dan instar III. Pada burayak instar I (baru menetas) gnotobasen setanya masih belum berbulu dan juga belum bercabang. 

Sekitar 24 jam setelah menetas, burayak akan berubah menjadi instar II. Lebih lama lagi akan berubah menjadi instar III.Pada tingkatan II, gnotobasen setanya sudah berbulu tapi masih belum bercabang. Sedangkan pada instar III, selain berbulu gnotobasen seta tersebut sudah bercabang II.

Pada tingkatan instar II, burayak mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari makan, bersamaan dengan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya dengan cara menggerak-gerakkan antena II-nya. Selain itu untuk mengumpulkan makanan antena II juga berfungsi untuk bergerak. Tubuh instar II dan instar III sudah lebih panjang dari instar I.

Pada tingkatan selanjutnya, disebelah kanan dan kiri mata nauplius mulai terbentuk sepasang mata majemuk. Mula-mula masih belum bertangkai. Kemudian secara berangsur-angsur berubah menjadi bertangkai. Selain itu, dibagian samping badannya (kanan dan kiri) juga berangsur-angsur tumbuh tunas kakinya (torakopada). Mula-mula tumbuh dibagian depan kemudian berturut-turut disusul oleh bagian-bagian yang lebih ke belakang. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah masa burayak, dan berubah menjadi artemia dewasa.

E. Uraian Tanaman 
1. Klasifikasi Jarak Merah (Jatropha gossypifolia)
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Dicotyledoneae
Ordo : Euphobiales
Family : Euphorbiaceae
Genus : Jatropha
Spesies : Jatropha gossypifolia L.

2. Morfologi Tanaman
Jarak merah (Jatropha gossypifolia) tergolong kedalam kelompok tanaman berdaun tidak lengkap. Hal ini karena pada bagian daunnya hanya memiliki petiolus (tangkai daun) dan lamina (helaian daun), tanpa memiliki pelepah daun. Circumscriptio atau bangun daunnya berbentuk orbicularis (bulat). Dikatakan memiliki bangun daun berbentuk orbicularis karena pada perbandingan panjang dan lebar, jarak merah yaitu 1 : 1. Memiliki intervenium (daging daun) yaitu tipis lunak (herbaceus). Pada bagian margo folii, daunnya bergerigi (serratus). Pada bagian apex folii, daunnya meruncing (acuminatus). Karena pada titik pertemuan kedua tepi daunnya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan ujung daun yang berbentuk runcing (acutus), dan ujung daun nampak sempit memanjang dan runcing. 

Bagian basis foliinya berlekuk (emarginatus), hal ini ditemukan pada daun-daun bangun jantung, ginjal, dan anak panah. Permukaan daunnya yaitu gundul (gleber). Susunan tulang-tulang daun (nervatio) dari jarak merah adalah menjari (palminervis). Dikatakan menjari, karena dari ujung tangkai daun keluar beberapa tulang yang memencar, memperlihatkan susunan jari-jari seperti tangan

F. Prosedur Kerja
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN


A. Hasil Pengamatan
1. Tabel Pengamatan
LAPORAN UJI TOKSISITAS METODE BSLT SECARA BIOASSAY

B. Pembahasan
Bioassay adalah suatu test atau uji yang menggunakan organisme hidup untuk mengetahui efektifitas suatu bahan hidup ataupun bahan organik dan anorganik terhadap suatu organisme hidup. Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi, oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian.

Toksikologi adalah pengetahuan tentang efek racun dari obat terhadap tubuh dan sebetulnya termasuk pula dalam kelompok farmakodinamika, karena efek terapeutis obat berhubungan erat dengan efek toksisnya. Pada hakikatnya setiap obat dalam dosis yang cukup tinggi dapat bekerja sebagai racun dan merusak organisme (“Sola dosis facit venenum”: hanya dosis membuat racun, Paracelsus). 

Pohon jarak merah yang disebut (Jatropha gossypifolia L) dalam bahasa latin merupakan tanaman jenis etobotani yang dapat juga digunakan sebagai sumber obat tradisional, beberapa manfaat banyak terdapat pada setiap jaringan tanaman ini. Misalnya bijinya dapat digunakan sebagai obat pencahar, namaun dari beberapa informasi yang ada sekarang penggunaan biji tanaman ini sebagai obat herbal sangat dilarang karena terdapat kandungan toksiksitasnya yang tinggi. Salah satu negara yang melarang penggunaan tanaman ini sebagai obat herbal yakni negara Thailand, biasanya tanaman ini juga digunakan sebagai etoveterinari oleh para pemburu untuk mengobati luka bekas gigitan ular, luka kudis pada anjing pemburu, dan juga mengobati bekas sengatan kalajengking. Jarak merah (Jatropha gossypifolia) tergolong kedalam kelompok tanaman berdaun tidak lengkap. Hal ini karena pada bagian daunnya hanya memiliki petiolus (tangkai daun) dan lamina (helaian daun), tanpa memiliki pelepah daun.

Salah satu metode yang digunakan untuk menguji senyawa yang memiliki bioaktivitas sebagai antikanker dari senyawa yang diisolasi adalah Brine shrimp lethality test (BSLT), dimana tujuan dari penggunaan metode ini adalah sebagai uji pendahuluan yang dapat mendukung penemuan senyawa-senyawa antikanker. Senyawa yang diduga memiliki aktivitas anti kanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan percobaan. Penelitian ini menerapkan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST) dengan menggunakan larva udang Artemia salina leach sebagai hewan uji. Metode ini merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa anti kanker baru yang berasal dari tanaman. Artemia salina Leach adalah udang tingkat rendah yang hidup sebagai zooplankton. Artemia pada tahun 1778 diberi nama cancer salinus,yang kemudian diubah menjadi Artemia salina pada tahun 1819 oleh Leach.

Artemia sebelumnya telah digunakan dalam bermacam-macam uji hayati seperti uji pestisida, polutan, mikotoksin, anestetik, komponen seperti morfin, kekarsinogenikan dan toksikan dalam air laut. Uji dengan organisme ini sesuai untuk aktifitas farmakologi dalam ekstrak tanaman yang bersifat toksik. Penelitian menggunakan Artemia salina memiliki beberapa keuntungan antara lain cepat, mudah, murah dan sederhana.

LC50 adalah konsentrasi dari suatu senyawa kimia di udara atau dalam air yang dapat menyebabkan 50% kematian pada suatu populasi hewan uji atau makhluk hidup tertentu. Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan uji secara berkelompok yaitu pada saat hewan uji dipaparkan suatu bahan kimia melalui udara maka hewan uji tersebut akan menghirupnya atau percobaan toksisitas dengan media air. Nilai LC50 dapat digunakan untuk menentukan tingkat efek toksik suatu senyawa sehingga dapat juga untuk memprediksi potensinya sebagai antikanker.

Penentuan konsentrasi yang berbeda merupakan langkah dengan menyiapkan konsentrasi dari masing-masing sampel yaitu konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml untuk membandingkan toksisitas dan efek toksik yang ditimbulkan masing-masing konsentrasi tersebut. Juga untuk melihat pada konsentrasi berapakah larva udang mengalami LC50. air laut sebagai kontrol dimaksudkan untuk melihat apakah respon kematian dari sampel dan bukan dari laut. digunakan karena tanaman tersebut memiliki khasiat sebagai obat antikanker, dan alasan digunakannya larva udang dalam percobaan ini adalah karena larva udang merupakan general biossay sehingga semua zat dapat menembus masuk melalui dinding sel larva tersebut.Pra perlakuan merupakan langkah pertama yakni menyiapkan larva udangnya. Pertama-tama Kista udang Artemia Salina leach dimasukkan kedalam wadah penetasan yang berisi air laut dan telah dilengkapi dengan aerasi dan lampu. Biarkan 48 jam hingga menjadi larva. Setelah itu membuat larutan sampel dengan masing-masing konsentrasi. Hal pertama yang dilakukan adalah Sampel Lada Hitam (Piper nigrum L.) 0,5 g dilarutkan dalam 500 ml aquades (larutan induk 1000 μg/ml) kemudian diencerkan untuk dibuat beberapa konsentrasi (4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 12,5 ppm). Setelah itu, dimasukkan ke dalam botol vial dan keringkan. Lalu, dipipet 10 ml air laut di botol vial, dimasukkan 10 ekor larva Artemia Salina L, dan didiamkan selama 24 jam. Kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan dihitung nilai LC50. 

Pengujian diatas diperoleh hasil pada kelompok kami yaitu pada konsentrasi 4000 ppm, 2000 ppm, 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 125 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm dan 12,5 ppm diperoleh jumlah larva yang mati dari hasil rata – rata botol I, botol II, dan botol III masing-masing yaitu 8, 7, 7, 6, 5, 5, 4, 3, 3, dan 3 dengan nilai mortalitas 80 %, 70 %, 70 %. 60 %, 50 %, 50 %, 40 %, 30 %, 30 %, dan 30 %. Setelah didapat log konsentrasi diperoleh persaman regresi yaitu y= 0,011x + 41,53. Dengan perolehan nilai LC50 adalah 4,3 x 1014 μg/ml. Artinya konsentrasi larutan sampel yang menyebabkan kematian dengan nilai LC50 adalah konsentarsi 4,3 x 1014 μg/ml. Angka kematian hewan coba dihitung sebagai Median Lethal Dose (LD50) atau Median Lathal Concentration (LC50). Penggunaan LC50 dimaksudkan untuk pengujian ketoksikan dengan perlakuan terhadap hewan coba secara inhalasi atau menggunakan media air. Kematian pada hewan percobaan digunakan sebagai pedoman untuk memperkirakan dosis kematian pada manusia.

BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa ; 
  1. Prinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam salah satunya adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). 
  2. Uji Bioassay dengan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) yaitu dengan melakukan uji toksisitas akut dimana efek toksik dari suatu senyawa ditentukan dalam waktu singkat, yaitu rentang waktu selama 24 jam setelah pemberian dosis uji. Prosedurnya dengan menentukan nilai LC50 dari aktivitas komponen aktif tanaman terhadap larva Artemia salinaLeach. Suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC < 1000 μg/ ml.

DAFTAR PUSTAKA
Arullapan, S., Muhamad, S., dan Zakaria, Z., 2013, Cytotoxic Activity of the Leaf and Stem Extracts of Hibiscus rosa sinensis (Malvaceae) against Leukaemic Cell Line (K-562), Tropical Journal of Pharmaceutical, Vol. 5 (12). 

Boyd, Claude E., LC50 Calculations Help Predict Toxicity, Global Aquaculture Advocate, Auburn University. 

Goyal, R.K., 2008, Pharmacology Principles and Methods of Bioassay, College of Pharmacy, Navrangpura 

Isnawati, Ani, dkk., 2004, Karakterisasi Simplisia dan Ekstrak Daun Strobilanthus Crispus, Jurnal Media Litbang Kesehatan, Vol. 14 (2) 

Mudjiman, A., 1998, Udang Renik Air Asin, Bhrata Karya Aksara, Jakarta.

Pandey, Amita, dan Tripathy, Shalini, 2014, Concept Of Standardization, Extraction And Pre Phytochemical Screening Strategies For Herbal Drug, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, Vol. 2 (5) 

Pisutthanan, S., dkk., 2004, Brine Shrimp Lethality Activity of Thai Medicinal Plants in the Family Meliaceae, Narefuan University Journal, Vol. 12 (2)

Rani, S. K. S., Saxena, N., Udaysree, 2013, Antimicrobial Activity of Black Pepper (Piper nigrum L.), Global Journal of Pharmacology, Vol. 7 (1)

Wrightson, 2007, “LD50” [LETHAL DOSE 50 %], Advancing the Chemical Sciences, Burlington house, London.